非洲猪瘟诊断技术研究进展

张华莹，符乐，王晓芳，王亚文

（河北省畜牧兽医研究所，河北保定 071000）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染所有品种和年龄的野猪和家猪的病毒性疾病， 该病的特征是高烧、网状内皮系统严重出血、高死亡率和高传染性。 以感染猪发热、精神抑郁、食欲不振、便血和鼻出血为主要临床特征； 以患病猪全身组织器官广泛性出血和脾脏发黑、 异常肿大为主要病理变化[1]。 1921 年，非洲肯尼亚首次发现非洲猪瘟，随后，全球多个国家报告了非洲猪瘟疫情。2018 年8 月，中国沈阳市首次发现非洲猪瘟，经检验并确定其流行毒株为基因II 型，与俄罗斯流行的毒株在同一分支[2]。 首次暴发以来，截止现在， 非洲猪瘟几乎在我国所有省份和地区都有发生， 并对我国的畜牧业造成了不可挽回的损失。 据估计，2018 年至2019 年有超过3000 万头生猪被扑杀， 给全球生猪生产造成了约20 亿美元的经济损失，截止到2022 年，非洲猪瘟造成的损失约为550 亿～1300 亿美元。

虽然近年来，非洲猪瘟的流行趋势平缓，但是散发和亚临床感染情况仍然存在， 我国的防控形势依然不容乐观。 由于没有特效药物和疫苗，因此，科学有效的检测和早期诊断对于疫情控制至关重要， 发现并立即扑杀感染猪以及执行严格的生物安全措施是我国目前防控非洲猪瘟的主要措施。 非洲猪瘟的实验室诊断主要分为两类，一类为病原学诊断，主要为病毒和病毒核酸的检测方法；另一类为血清学诊断，主要为诊断机体因抗原刺激而产生的抗体或因病毒感染而产生的抗原。 在非洲猪瘟暴发初期，普遍采用PCR 等病原学检测以确诊病例[3]。非洲猪瘟的血清学诊断在疫情监测中也起着关键作用，几种包被p72、p54、p30、p12 等蛋白的ELISA 已被证实可用于非洲猪瘟的流行病学调查[4]。 但是当血清保存不良或使用血液代替血清时， 这些ELISA 的敏感性可能会降低。在非洲猪瘟呈地方流行趋势后，特别是弱毒株的出现，加大了非洲猪瘟病毒的检测难度， 病原学和血清学诊断的结合应用对可疑猪只、 隐性感染猪只的确诊更加有利。 本文重点讨论了非洲猪瘟实验室诊断技术的研究进展， 以期为非洲猪瘟的防控工作提供有价值的参考。

1 非洲猪瘟的病原学诊断

非洲猪瘟因其发病快、病程短、死亡率高，临床表现和病理变化与经典猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征等猪病相似，主要包括高热、大面积出血、呼吸和生殖障碍等，使得这三种猪病的鉴别诊断非常困难， 需要通过实验室诊断进一步区分[5]。

1.1 病毒的分离与红细胞吸附试验

病毒的分离和红细胞吸附试验是非洲猪瘟活病毒检测的“金标准”。 该病毒既可以在原代细胞如：猪外周血单核细胞、肺泡巨噬细胞等中增值， 又可以在传代细胞系中增殖。 有研究报道， 非洲猪瘟病毒在肺泡巨噬细胞中的易感性比外周血单核细胞高近5 倍。 此外，该病毒可在感染细胞中产生细胞病变效应和红细胞吸附现象[6]，这是非洲猪瘟病毒感染细胞特有的现象，其他猪病毒无法引起单核细胞和巨噬细胞吸附红细胞， 因此红细胞吸附试验可用于非洲猪瘟的诊断。 野外采集样本的质量与病毒生存成正相关， 由于样本质量不佳导致病毒分离难度加大。 还有研究发现，有些毒株不产生红细胞吸附但是可以产生细胞病变， 导致了出现假阴性的结果，同时红细胞吸附试验鉴定过程相对较长，无法满足临床的快速诊断。

1.2 病毒核酸检测

1.2.1 PCR 及qPCR 检测

病毒核酸检测是病毒检测最常用的方法之一，具有特异性良好、灵敏度高、稳定性好等优点。 非洲猪瘟核酸检测方法主要包括PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增。其中PCR 和荧光定量PCR 是实验室诊断最常用的实验技术， 后者的灵敏度更高，速度更快，应用也更广泛。 宝梅英[7]等通过增加探针内标物及优化反应条件，建立了非洲猪瘟病毒双重荧光探针PCR 检测方法，该方法最低每微升可检测28 个拷贝，高于PCR 方法40 倍以上，重复性、稳定性和特异性较好，不于其他病毒核酸交叉反应。 王彩霞[8]等利用CD2v 基因建立了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR 检测方法，通过条件的优化，确定该方法的R2=0.988，最低每微升可检测到10 个拷贝,且该方法的重复性和特异性良好， 不于其他猪病发生交叉反应， 为非洲猪瘟病毒检测提供了新的检测技术。

1.2.2 环介导等温扩增

环介导等温扩增是一种新的核酸扩增技术，具有快速、简便和高特异性等优点，已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域， 对于疫病的现场诊断具有非常重要的意义。 虽然世界动物卫生组织推荐的非洲猪瘟诊断方法是荧光定量PCR， 尽管该技术已经被广泛验证，并且是检测病毒有用工具，但是由于昂贵的仪器和专业的操作系统，仍然不方便。 另外，还有研究学者利用p72 基因，设计了3 对扩增引物和1 条环介导等温扩增探针引物， 建立了非洲猪瘟病毒实时荧光的环介导等温扩增方法，该方法的灵敏度高，并且该方法与OIE 推荐的PCR 方法进行比较，符合率高度一致[9]。

1.2.3 荧光抗体试验

免疫荧光试验可分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法，该方法特异性强、敏感性高，相对于红细胞吸附试验，免疫荧光试验更加省时、方便， 并且可对不能产生红细胞吸附现象的非洲猪瘟病毒进行诊断。 该方法被OIE 列为非洲猪瘟的辅助诊断方法， 用于其他检测试验的补充。 免疫荧光试验需要用荧光素对特异性抗体进行标记，但对荧光素的特异性要求较高，非特异性的荧光素染色会造成阳性检出率增高；并且对于急性ASF 检出率较高， 对于亚急性和慢性的检出率较低。 此外，该试验对检测人员有较高的技术要求，结果判定需要借助荧光显微镜，不适用于现场检测。

2 ASF 的血清学诊断

2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）主要是依靠包被的抗原或抗体， 抓取待检样本中的特异性抗原或抗体， 再与辣根过氧化物酶标记的抗原或抗体结合成抗原抗体复合物， 最后使底物和酶发生颜色反应， 通过测定吸光度值即可对结果进行判定。 根据检测方法的不同可分为间接ELISA[4]、阻断ELISA[10]和夹心ELISA[11]等。ELISA检测抗原的方法相对于PCR 检测方法， 其检测成本更低、操作便捷、可同时检测大批量样本。但是与PCR 相比，ELISA 检测抗原的方法，特异性较差、灵敏性稍低，易于出现假阳性的结果。如果待检样品保存不当， 如保存温度较高或保存时间较长均会对结果的准确性造成影响。ELISA 抗体检测方法具有特异性强、 敏感性高、重复性好和检测速度相对较快等优点， 因此非常适用于 “群体” 检测和流行病学调查， 此外ELISA 也是OIE 推荐的首选血清学检测方法。

张文燕[4]等以截短p72 基因作为包被抗原，建立了非洲猪瘟抗体检测的间接ELISA 方法，经过条件的优化， 最终确立该方法的包被浓度为每毫升0.5 微克，最佳待检测血清做1∶100 稀释，HRP 标记的二抗最佳稀释倍数为1∶5000，该方法不于其他抗体发生反应， 且该方法与蛋白质印迹的检出率一致， 证明了建立的该方法可在非洲猪瘟的临床检测和流行病学调查用有极大的应用潜力。

2.2 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型膜检测技术。 胶体金标记的特异性抗原或抗体在毛细作用下，可以在硝酸纤维素膜中移动， 与相应的抗体或抗原结合，从而使胶体金颗粒大量聚集，而呈现出显色反应。 随着各类新技术的发展，免疫胶体金技术也在不断更新换代，因其操作方法简便，不需要专业设备和人员进行操作、快速、便宜且测试结果明确等特点在非洲猪瘟的检测中有广大的前景。张鑫宇[12]等建立了非洲猪瘟p54 抗体检测胶体金方法，该方法的灵敏度较高、反应时间较短（10 分钟内）。 张丽[13]等通过原核表达、纯化获得了非洲猪瘟病毒p54 蛋白， 制备了胶体金检测试纸条， 与西班牙INGENASA 公司的试纸条的检测限敏感性高10 倍。

2.3 化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术是基于抗原、抗体免疫反应的原理， 结合化学发光而建立的一种免疫分析技术。 化学发光免疫分析技术是以化学发光作为指示系统， 使用相关的化学发光物质标记特异性抗体或抗原， 与待检样本特异性结合，再加入能使发光物发光的物质，根据发光物发射光的信号强弱判定待检样本的浓度[14]。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、检测范围广、反应速度快、分析时间短、操作简单等特点。 凭借其高灵敏度和特异性， 不断促进对科学技术和研究领域的新理解。 现如今，该技术已经应用到疫病的临床诊断中，

3 其他检测技术

非洲猪瘟因发病快、传播广等特点，已成为当今养猪业的首号威胁者，因此，建立特异、便捷、 快速的检测方法对于非洲猪瘟的防控工作至关重要。 该病毒检测技术的研究，可以为不同地区在特定非洲猪瘟疫情流行背景下选择合适的诊断试剂提供参考， 促使各个领域的检测技术迅速进入动物医学行业。谢青云[15]等为了建立快速、敏感的现场诊断检测方法，制备了基于量子点微球偶联非洲猪瘟p30 蛋白的检测用探针， 和量子点微球偶联的兔抗鸡的IgY 质控探针，建立量子点免疫试纸条，该试纸条以猪的咽拭子为检测对象，待检液做2 倍稀释，该方法的敏感性较好，且不于其他猪病交叉反应，20 分钟内即可完成检测，最早可在感染后6 天检测出，为非洲猪瘟的早起诊断提供技术支持。 另外，岳怀宁[16]等建立了非洲猪瘟重组酶辅助扩增和胶体金试纸条相结合的可视化检测方法， 该方法通过反应条件的优化，确定在38℃下反应20 分钟即可完成该病的核酸检测， 并且不与其他猪病发生交叉反应，最低可检测到48.75 个拷贝的病毒核酸，该方法操作便捷，反应时间短，极适合非洲猪瘟的临床快速诊断。

4 总结与展望

近期研究报道， 在中国猪体内检测到自然发生的基因I 型和基因II 型非洲猪瘟重组体，动物试验也表明了， 这些病毒具有高度致命性和传染性， 且以基因Ⅱ型病毒为基础的减毒活疫苗不能对这些重组病毒提供保护， 非洲猪瘟对我国养猪业造成的危害进一步增大，所以，检测方法的研究对于非洲猪瘟病毒早期诊断至关重要。

PCR、 胶体金试纸条、ELISA 等检测方法虽然方便、快捷，但是不同检测方法的灵敏度和特异性不同。 国内外多位研究学者报道了ASF 的检测方法，可以对该病进行有效的鉴别诊断，但是其中多数检测方法属于基础性研究， 缺乏大量的临床样本应用， 甚至有的检测方法对检测环境或检测仪器设备有较高的要求， 很难在实际应用中有效推广。PCR 及qPCR 检测方法需要对样本进行前处理才能进行核酸提取和扩增，整个流程时间较长、 核酸提取和扩增相关仪器价格昂贵，适合实验室诊断，不利于现场快速诊断。 ELISA 检测技术需要仪器设备相对较少，检测时间短， 一次可检测大量样本， 适合群体检测。 但是，因为抗体产生的时间不同，很难通过抗体检测筛查处于潜伏期的猪只。 胶体金试纸条检测时间短，适合用于现场检测，但其敏感性和特异性还需要继续优化。

本文总结了非洲猪瘟不同检测方法， 并对各检测方法的优点和不足进行了总结。 针对这些存在的问题，未来的研究应集中于低成本、工业化、高通量、高性能等方向，分子学检测方法在提高该病的检测性能方面十分有效， 将分子学检测方法与目前免疫学方法等相结合可以降低成本、提高检测通量和灵敏度。 随着非洲猪瘟不断传播及不同毒株的重组， 使得该病毒的危害不断增强，因此，迫切需要开发出敏感性高、特异性好，并且适合现场快速诊断检测方法。

（基金项目： 河北省现代农业产业技术体系奶/肉牛综合试验推广站（HBCT2023180406）；河北省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队保定综合试验推广站（HBCT2023170404））