宫颈癌辐射敏感性差异基因的筛选及免疫相关性分析

胡煜，王含梦，陈然众，彭昌民，李乐，唐双阳

1 南华大学公共卫生学院，湖南衡阳 421001；

2 南华大学衡阳医学院基础医学院病原生物学研究所

宫颈癌是发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤，是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤。放射治疗是指利用由辐射产生的粒子束治疗恶性肿瘤的方法，是治疗包括宫颈癌在内的多种肿瘤的常用手段，但放疗对晚期宫颈癌的治疗效果较差［1］。免疫治疗指利用宿主免疫系统杀死肿瘤细胞从而治疗癌症［2］，对于标准化治疗失败的宫颈癌患者，免疫治疗是可改善其预后的一种治疗手段［3］。放射治疗在杀死肿瘤细胞的同时可以产生深远的免疫刺激作用，有助于使免疫治疗不敏感肿瘤变得敏感，因此放射治疗及免疫治疗联合应用对恶性肿瘤具有良好的治疗前景。宫颈癌的发生发展、辐射敏感性、免疫刺激反应都受细胞内某些基因的调控，寻找在这三者中均发挥作用的基因可能有助于更好的了解宫颈癌的免疫放射联合治疗机制。2022 年10 月—2023 年6月，本研究通过生物信息学方法筛选影响宫颈癌辐射敏感性的相关差异基因并进行表达验证以及免疫相关性分析，以期为宫颈癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 宫颈癌辐射敏感性差异基因的筛选

1.1.1 数据来源及处理 从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https：//www. ncbi. nlm. nih.gov/geo/）中下载基因表达数据集GSE6213、GSE166466、GSE6791、GSE64217，分别基于平台GPL2895，GPL23126，GPL570 及GPL10588，其中GSE6213 数据集包含放疗前后宫颈癌组织共28个样本，GSE166466、GSE6791、GSE64217 数据集分别包含14、16、4 个正常宫颈组织及宫颈癌组织样本。对4 个数据集中的样本数据均进行标准化处理。

1.1.2 差异基因筛选 基于R 3.40.2软件的limma包对GEO得到4个数据集的mRNA表达谱进行校正和归一，分析调整后的P值以纠正假阳性结果。以调整后P＜0.05 且|log2FC|＞1 作为宫颈癌辐射敏感性差异基因筛选的阈值。使用韦恩图将得到的差异基因取交集。

1.2 宫颈癌辐射敏感性差异基因的表达验证

1.2.1 差异基因的表达分析 从The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库及Genotype-Tissue Expression（GTEx）数据库收集306 例宫颈癌组织样本、22例正常宫颈组织样本的表达数据及患者临床资料、随访数据，通过Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA2）数据库对筛选出的宫颈癌辐射敏感性差异基因进行表达分析，验证所选差异基因是否可靠。以P＜0.01 且|log2FC|＞1 作为基因差异表达的阈值，其中P＜0.01 且|log2FC|＞1 为基因在宫颈癌组织中高表达，P＜0.01且|log2FC|＜1为基因在宫颈癌组织中低表达。

1.2.2 差异基因的生存分析及关键差异基因筛选通过GEPIA2 数据库进行生存分析，将差异基因在肿瘤中的中位数作为高、低表达的分界线，以P＜0.05 为标准，筛选不同基因表达水平对患者预后有影响的差异基因为宫颈癌辐射敏感性关键差异基因。

1.2.3 关键差异基因的预后分析 通过TCGA 数据库及GTEx 数据库收集宫颈癌患者临床资料及随访数据，通过R 软件“forestplot”包对数据进行单因素、多因素COX 回归分析，验证筛选出的关键差异基因是否为宫颈癌患者预后的影响因素。

1.2.4 关键差异基因的蛋白表达验证 通过The Human Protein Atlas（HPA）数据库比较筛选出的关键差异基因在宫颈癌以及正常宫颈组织中的蛋白表达。

1.3 宫颈癌辐射敏感性差异基因的免疫相关性分析

1.3.1 关键差异基因GO功能及KEGG信号通路富集分析 基于LinkedOmics 数据库通过基因集富集分析得到关键差异基因的GO 功能及KEGG 信号通路富集分析结果，其中GO 分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）。

1.3.2 关键差异基因免疫相关性分析 通过Tumor Immune Estimation Resource（TIMER）数据库分析关键差异基因在宫颈癌中的表达与免疫细胞浸润水平的关系。通过TCGA 数据库数据使用CIBERSORT 进行免疫评分并观察免疫检查点相关基因的表达情况，通过R 软件包“ggplot2”及“pheatmap”对结果进行可视化，将关键差异基因与宫颈癌高度相关的免疫检查点基因使用Spearman 进行相关性分析，以P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌辐射敏感性差异基因筛选结果GSE6213、GSE166466、GSE6791、GSE64217GSE6213数据集中分别筛选出差异基因417、2 799、2 347、4 092 个，通过韦恩图将差异基因取交集，筛选出共同差异基因10 个，分别为HELLS、TOP2A、KIF23、TAP1、WDR76、LMNB1、RFC4、TFRC、IFI44L、IFIT3。见OSID码图1

2.2 宫颈癌辐射敏感性差异基因表达验证结果表达分析结果显示，10 个差异基因均在宫颈癌组织中高表达（OSID 码图2）；生存分析结果显示，TFRC 高表达的宫颈癌患者总生存率及无病生存率低于TFRC 低表达的患者，其他差异基因高、低表达患者总生存率及无病生存率比较没有统计学意义（OSID 码图3）。故选择TFRC 为宫颈癌辐射敏感性关键差异基因进行后续研究。单因素COX 回归分析结果显示，TFRC 及宫颈癌TNM 分期是宫颈癌患者预后的影响因素（OSID 码图4）；多因素COX回归分析结果显示，TFRC 及宫颈癌TNM 分期是宫颈癌患者预后的独立影响因素（OSID 码图5）。通过HPA 数据库验证TFRC 在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的蛋白表达，结果显示TFRC 在正常宫颈组织中未检测到，在宫颈癌组织中呈高表达（OSID码图6）。

2.3 宫颈癌辐射敏感性差异基因的免疫相关性分析结果 GO 功能分析显示，TFRC 主要涉及染色体分离、RNA 定位、适应性免疫反应等BP（OSID 码图7），染色体区、核糖前体、免疫突触等CC（OSID 码图8），解旋酶活性、组蛋白结合、抗原结合等MF（OSID 码图9）。KEGG 信号通路富集分析显示，TFRC 主要与RNA 转运、细胞周期、同种异体移植物排斥反应等信号通路有关（OSID 码图10）。TIMER 数据库分析结果显示，宫颈癌中TFRC 表达与细胞纯度呈正相关，与CD8+T 淋巴细胞呈负相关，TFRC 表达影响记忆B 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、巨噬细胞M0、静息肥大细胞的浸润程度（OSID 码图11）。Spearman 相关性分析显示，TFRC 表达与大部分宫颈癌免疫检测点相关基因呈负相关（OSID码图12）。

3 讨论

目前，放射与免疫联合治疗是一种较有潜力的，可改善宫颈癌患者预后的治疗方法，因此寻找宫颈癌辐射敏感性差异基因并探讨其免疫功能及致病机制对宫颈癌的治疗有重要意义。本研究通过生物信息学分析，筛选出了同时影响宫颈癌发生进展及辐射敏感性的关键差异基因TFRC。

TFRC 是一种转铁蛋白受体，其主要功能是与转铁蛋白结合从而影响细胞对铁的吸收。而细胞内过量的铁会诱导芬顿反应，造成DNA 损伤或细胞死亡［4］。铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡，其特征是线粒体的改变、过量铁的异常积累以及脂质堆积，积累的脂质过氧化物会损伤细胞。本研究发现，TFRC 在宫颈癌中高表达。同时，多项研究表明，TFRC 在其他肿瘤中也存在高表达，如在神经母细胞瘤中，TFRC 过表达并诱导了神经母细胞瘤对铁死亡的选择性敏感［5］；在胶质瘤中，TFR2 高表达与患者不良预后相关，且TFR2 过表达能通过促进胶质瘤细胞中活性氧的产生和脂质过氧化促进铁死亡［6］；在胰腺癌中，TFRC 表达水平增加且与不良预后相关［7］；在卵巢癌中，TFRC 通过上调AXIN2 表达促进卵巢癌上皮细胞的增殖和转移［8］；在结肠癌中，TFRC 高表达可促进结肠上皮细胞存活，抑制TFRC表达能增强DNA 损伤反应，降低结肠肿瘤生长速度［9］。在宫颈癌中，TFRC 能通过影响HeLa 细胞的基因表达和选择性剪接参与宫颈癌的进展［10］，且TFRC高表达可上调EIF4A3从而促进宫颈癌细胞的增殖［11］。本研究发现，TFRC 表达上调对宫颈癌预后不利。但也有研究发现，TFRC 作为铁代谢重要蛋白，其表达升高可以增加氧气的运输，改善缺氧，使HIF-α 蛋白更容易羟基化，从而抑制宫颈癌细胞的转移［12］。因此，TFRC 可能通过多种机制影响宫颈癌的进展。

在TFRC 影响肿瘤细胞辐射敏感性方面，有研究表明，在人外周血B 淋巴细胞AHH-1 中，TFRC 的表达对低剂量辐射敏感［13］。而由于TFRC 可调节转铁蛋白来参与细胞内铁的调节，有研究表明在三阴性乳腺癌中，沉默转铁蛋白的表达可以减少辐射诱导的细胞死亡［14］；在鼻咽癌中，放疗前的血清转铁蛋白水平会影响鼻咽癌患者放射敏感性［15］。关于TFRC 在宫颈癌中如何影响辐射敏感性目前还缺乏研究，但推测其可能通过转铁蛋白影响宫颈癌的辐射敏感性，后续可以进行相关实验进行论证。同时，本研究对TFRC 进行KEGG 信号通路富集分析显示，TFRC 可通过影响细胞周期发挥作用，而细胞周期可能是影响辐射敏感性的重要因素之一，这也提示TFRC 能够影响宫颈癌的辐射敏感性［16］。

在TFRC 影响免疫学效应方面，有研究发现TFRC 突变会导致小鼠联合免疫缺陷，提示TFRC 在适应性免疫中具有重要作用［17］；在胰腺癌和肝细胞癌中，TFRC 与免疫细胞浸润有关［7，18］；在系统性红斑狼疮中，患者疾病严重程度与TFRC 表达相关，且体外阻断TFRC 能降低T 淋巴细胞内铁摄取水平并抑制mTORC1 信号，从而导致T 淋巴细胞功能障碍［19］。本研究结果显示，在宫颈癌中TFRC 与CD8+T淋巴细胞的浸润有关。通过对TFRC进行GO功能分析发现，TFRC 可能与适应性免疫反应相关。对TFRC 进行免疫相关性分析发现，TFRC 与大部分宫颈癌相关的免疫检测点基因呈负相关，这些都提示其可在宫颈癌的免疫治疗中发挥作用，但具体机制仍不明确。

综上所述，本研究通过生物信息学分析发现，TFRC 为宫颈癌辐射敏感性差异基因，其可能与适应性免疫反应、宫颈癌相关的免疫检测点相关；这提示TFRC 可在宫颈癌的放射免疫治疗中发挥作用，从而影响宫颈癌的进展和预后。TFRC 可以作为预测宫颈癌患者免疫放射治疗效果及其预后的潜在靶点，但其具体作用机制仍需后续实验论证。