苎麻种质基因型对体细胞植株再生的影响

何鹏亮，蒋美艳，邢虎成，揭雨成*

(1 湖南农业大学苎麻研究所，湖南 长沙 410128； 2 湖南省草类作物种质创新与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)

苎麻(Boehmeria nivea)为荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Boehmeria)的多年生草本植物，主要分布在热带和亚热带地区，在世界上享有“中国草”(China grass)之誉称[1-3]。 其栽培历史在4 000 年以上，是我国最先利用的天然纤维之一[4]。 苎麻组织培养技术在苎麻品种改良、种质资源的繁殖和保存、杂种优势的固定和遗传转化等方面具有重要作用。 高再生率的体细胞再生体系对开展体细胞无性系变异规律研究及其种质创新极为有利。 迄今为止，苎麻离体再生体系的研究已取得了一定的进展，研究内容涉及基因型[5-10]、激素[11-16]、外植体类型[17-19]、基本培养基[8，20-21]等，但仍存在基因型差异显著、植株再生频率低、可重复操作性差等问题。 本试验研究苎麻种质基因型对体细胞植株再生的影响，以为苎麻的组织培养及植株再生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用6 个苎麻种质，分别是湘饲苎X4、湘饲苎X6、湘饲苎X7、A、B 和C，均由湖南农业大学苎麻研究所提供。

1.2 试验方法

将6 个苎麻种质种苗移栽于装有营养土的盆中进行培养，等植株长出新叶后，取嫩叶作为外植体，每个种质各接种30 片，3 个重复共90 片，用毛笔轻轻刷去杂质，用自来水冲洗，滤纸吸干，在超净工作台上用75%酒精浸洗25 s 后，用无菌水冲洗3 遍，再用0.1%升汞消毒7 min，用无菌水冲洗5 遍后，在无菌滤纸上将叶片切成0.5 cm×0.5 cm 的方块，并将其接种于愈伤组织诱导培养基上。 将叶块的下表皮贴于培养基上，于暗室中诱导愈伤组织，一般5 d后愈伤基本形成。 10 d 后将愈伤转接于不定芽诱导培养基上，培养条件:白天温度26±2 ℃，夜间为20±2 ℃，每天光照11 h，光照强度为1 500 ～2 000 Lx。 愈伤组织通过多次继代，分化出不定芽，再将不定芽转接在壮苗培养基上壮苗，待不定芽长至2 ～3 cm 时，再将其转接于生根培养基中，10 d 后可以长出新根，即为完整的再生植株。 愈伤组织、不定芽和根的诱导均设3 次重复。

1.3 培养基配方

愈伤组织诱导培养基:MS 培养基＋TDZ(噻苯隆，0.05 mg/L)＋2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，0.03 mg/L)＋IAA(吲哚乙酸，0.01 mg/L)。

不定芽诱导培养基:1/2 MS 培养基＋TDZ(0.5 mg/L)＋2，4-D(0.02 mg/L)＋IAA(0.03 mg/L)。

壮苗培养基:MS＋TDZ(0.05 mg/L)＋IAA(0.05 mg/L)。

生根培养基:MS＋TDZ(0.02 mg/L)＋NAA(0.05 mg/L)＋IAA(0.02 mg/L)。

1.4 数据处理及方法

采用Excel 2010 对数据进行初步整理，用DPS 9.01 软件进行方差分析。 本研究根据以下公式计算组织培养处理的愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和生根率[22]:

愈伤组织诱导率(%)＝(产生愈伤组织的叶片数/接种的叶片数)×100；

不定芽诱导率(%)＝(产生不定芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数)×100；

生根率(%)＝(生根小苗数/接种的不定芽数)×100。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导

6 个苎麻种质愈伤组织的诱导结果见表1 和图1。 在时间上，种质A、B 和C 在接种后第2 天叶片出现膨大，第3 天诱导出愈伤组织，湘饲苎X4 在第5 天出现愈伤组织，湘饲苎X6 和湘饲苎X7 脱分化的时间最长，第7 天才诱导出愈伤组织，且长出的愈伤组织不整齐。 颜色上，A、B 和C 分别出现了米白、浅黄和淡红等颜色，其他3 个种质的愈伤组织颜色较一致。 在愈伤组织的质量上，A、B 和C 的愈伤组织长势相对较强，质地疏松，成小瘤、颗粒状，且愈伤组织诱导率也较高，其中，C 的愈伤诱导率最高，达96.67%，A 和B 的愈伤诱导率均为90.00%；湘饲苎X6 和湘饲苎X7 的愈伤组织长势较弱，尤其是湘饲苎X7，愈伤组织质地呈蓬松状，少量的愈伤还出现了变褐现象，其愈伤组织诱导率最低，为30.00%，湘饲苎X6 为40.00%；湘饲苎X4 的愈伤组织诱导率为76.67%，处于中间位置，高于湘饲苎X6 和湘饲苎X7，但低于A、B 和C。

图1 不同苎麻种质培养15 d 的愈伤组织Fig.1 Callus of different ramie germplasm cultured for 15 days

表1 不同苎麻种质愈伤组织的诱导结果Table 1 Callus induction results of different ramie germplasm

2.2 不定芽诱导

将6 个种质的愈伤组织转接在不定芽诱导培养基上，每隔3 d 观察1 次，每隔3 个星期继代1 次，观察并记录结果(表2，图2)。 根据表2，第1 次继代后，每个种质都出现了不同程度的变褐现象，其中湘饲苎X4、湘饲苎X6 和湘饲苎X7 较严重，变褐的愈伤组织最后都出现死亡的现象，严重影响了不定芽诱导率；湘饲苎X4、湘饲苎X6 和湘饲苎X7 的不定芽诱导率分别为11.62%、8.33%、5.88%；种质A、B、C 的情况较好，特别是种质C。 第2 次继代后，愈伤组织分化出了少量的芽和簇芽，其中B 有15块愈伤分化出了根，A 的愈伤转绿，质地致密。 第3次继代后，A 和B 均分化出了芽，由于B 分化了根，不利于芽和苗的再生，A 的不定芽诱导率(24.52%)稍高于B(21.15%)，不定芽诱导率最高的是种质C(31.57%)。

图2 不同苎麻种质愈伤组织9 周后诱导出的不定芽Fig.2 Adventitious buds induced from callus of different ramie germplasm after 9 weeks

图3 不同苎麻种质的不定芽生根情况(转接至生根培养基后17 d)Fig.3 Rooting of adventitious buds in different ramie germplasm (17 days after transfer to rooting medium)

表2 不同苎麻种质不定芽诱导结果Table 2 Induction of adventitious buds from different ramie germplasm

2.3 壮苗培养情况

由于愈伤组织上长出来的不定芽太小，生长能力弱，不能直接接种在生根培养基中生根，而需要在壮苗培养基中继续培养壮苗。 即将诱导出不定芽的愈伤块转接在附加TDZ(0.05 mg/L)和IAA(0.05 mg/L)的MS 培养基中，每隔3 d 观察1 次，15 d 后观察发现，大部分不定芽生长较好，茎秆粗，叶子葱绿，也有少许不定芽生长较慢，芽苗较矮，叶子较小。

2.4 根的诱导

待不定芽长至2 ～3 cm，将其转接在附加TDZ(0.02 mg/L)、IAA(0.02 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)的MS 培养基上，10 d 后，6 个种质全部生根。 开始根少且短，植株矮小，1 周后，整个三角瓶的底部都布满了根，植株也随着长高长大，从而形成了完整的再生植株。

3 讨论

潘昌立等[5]研究发现，基因型是苎麻外植体诱导愈伤组织和再生植株的决定因素，在相同培养条件下，不同基因型苎麻叶愈伤组织的绿芽诱导率表现为:湘苎6 号(36.0%)＞湘苎2 号(34.0%)＞Q8(20.0%)＞芦竹青(8.8%)＞湘苎3 号(3.3%)＞C5(2.9%)。 刘瑛等[6]研究发现，基因型和培养基组分是影响苎麻体细胞植株再生的内因和主要外因，不同基因型苎麻叶愈伤组织的绿芽诱导率表现为:细野麻(36.0%)＞赣苎3 号(33.4%)＞湘苎2 号(32.0%)＞89-12(20.0%)＞湘苎3 号(3.3%)。 马雄风[7]研究发现，在相同培养条件下，不同基因型苎麻下胚轴愈伤的芽再生频率表现为:中饲苎1 号(83.77%)＞中苎1 号(81.77%)＞NC01(80.59%)；子叶愈伤组织的芽再生频率表现为:NC01(60.29%)＞中苎1 号(57.14%)＞中饲苎1 号(50.51%)。

王晓玲等[8]将湘苎6 号和湘苎2 号的叶片在附加2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2，4-D 的MS、MSB、LS、B5 和N6 等5 种培养基上进行培养，发现湘苎2号叶愈伤组织量均高于湘苎6 号。 王晓玲和彭定祥[9]研究发现，在附加0.5 ～2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA，0.5-2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2，4-D 的MS 培养基上进行培养，黄壳早、湘苎2 号、华苎3 号和巴西麻6 号适应性强，脱分化和分化均较容易，但华苎1 号脱分化难。 Wang 等[10]研究发现，苎麻不定芽再生情况取决于基因型，将6 种苎麻基因型在附加2.27 μM TDZ 和0.057 μM IAA 或2.27 μM TDZ 和0.054 μM NAA 的MS 培养基上培养，5041-3 的不定芽诱导率最高，分别为86.2%和64.5%，黄皮棍的不定芽诱导率最低，分别为46.5%和33.4%。

4 结论

本研究中，6 个苎麻种质的愈伤诱导率均较高，种质C 的愈伤诱导率最高，达96.67%，湘饲苎X7的愈伤诱导率最低，为30.00%；而6 个种质的不定芽诱导率却相对较低，种质C 的不定芽诱导率最高，为31.57%，湘饲苎X7 的不定芽诱导率最低，仅为5.88%。 综合分析，基因型是影响苎麻外植体愈伤组织诱导和不定芽形成的重要因素。