ESET通过lncRNA GMDS-AS1调控肝癌细胞增殖、凋亡、糖酵解的研究

黄俊玲，钟腾猛，黄森平，高鑫艳

作者单位：1右江民族医学院附属医院消化内科，广西壮族自治区 百色533000；2百色市人民医院肝胆外科，广西壮族自治区 百色533099；3右江民族医学院临床医学院，广西壮族自治区 百色533000

肝细胞癌（HCC）是世界范围内最常见的人类癌症之一，其死亡率居所有癌症之首［1］。HCC的发病是由于表观遗传的改变导致癌基因的激活和抑癌基因的失活，进而诱导的肝细胞癌［2］。表观遗传的改变包括异常甲基化、组蛋白修饰和核糖核酸（RNA）干扰，这不会改变遗传密码，但会影响mRNA的转录［3］。组蛋白甲基转移酶集合域分叉1（SET domain， bifurcated 1，ESET）基因位于染色体1q21上，编码143 kDa的蛋白质，具有多个功能域。大量研究证明，ESET在多种恶性肿瘤中高度表达，与肿瘤细胞的增殖、侵袭紧密相关［4］。ESET的过度表达与HCC进展、肿瘤侵袭性和HCC病人的低生存率显著相关，ESET的失活降低HCC细胞的增殖和迁移能力，表明ESET是HCC中的重要癌基因。遗憾的是，ESET发挥作用的潜在调控机制研究甚少。长链非编码RNA（lncRNA）起初被认为作为是多余的，现在很多研究已证实，lncRNA在生物功能调控中具有重要作用，尤其肝细胞癌［5］。多种多样的lncRNA在肿瘤的发生和转移中起关键作用［6］，但仍有部分新发现的lncRNA的作用仍不完全清楚。lncRNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1（GDP-Mannose 4，6-Dehydratase Antisense RNA1，lncRNA GMDS-AS1）是近期在肺腺癌中新发现的lncRNA［7］，其在肝癌中的作用尚未可知。本研究拟以肝癌细胞为研究对象，观察ESET、lncRNA GMDS-AS1在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞增殖、凋亡、糖酵解的作用，揭示ESET、lncRNA GMDS-AS1在肝癌细胞中发挥调控作用的潜在关系，为肝癌的治疗提供新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 样本来自右江民族医学院附属医院和百色市人民医院2019年1月至2020年1月期间接诊的行肝癌手术切除的49例病人的癌组织及对应的癌旁组织。所有病人均签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

人永生化正常肝细胞THLE-2、肝癌细胞HepG2购自美国菌种保藏中心；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco；Lipofectamin 3000试剂购自美国Thermo Fisher Scientific；TRIzol液购自美国Invitrogen；反转录试剂盒、定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒购自日本Takera；鼠抗ESET（A-1）单抗、ESET siRNA质粒购自美国圣克鲁斯生物；兔抗细胞增殖抗原标志物Ki-67单抗、兔抗葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）多抗、兔抗乳酸脱氢酶A（LDHA）单抗、兔抗活化胱天蛋白酶-3（C-caspase-3）单抗均购自Cell Signaling Technology；HRP标记的二抗购自北京索莱宝公司；细胞计数试剂盒（CCK8）购自上海东仁化学研究所；膜联蛋白-V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自上海翌圣生物；RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）试剂盒购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 THLE-2、HepG2细胞使用混有10%胎牛血清的DMEM培养液培养。培养条件为37 ℃、5%二氧化碳的恒温细胞培养箱中培养，隔天更换一次培养液。

1.2.2 细胞转染与分组 正常培养的THLE-2、HepG2细胞设为THLE-2、HepG2组。将HepG2细胞分为空白组（不做任何处理）、空载体组（转染pcDNA或si-con）、敲减ESET组（转染si-ESET）、过表达lncRNA GMDS-AS1组（转染pcDNA-GMDS-AS1）。具体的转染方法：使用3倍的Lipofectamin 3000转染试剂与各组待转染物质（DNA或质粒）混合与HepG2细胞共转染8 h，更换新培养液继续培养。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）或蛋白质印迹法确认转染效率。

1.2.3 qRT-PCR实验检测ESET、lncRNA GMDSAS1的表达 收集细胞，Trizol液提取总RNA，反转录试剂盒合成互补DNA（cDNA），-20 ℃保存待用。以cDNA为模板qPCR实验的模板，按照qPCR试剂盒要求操作，检测分析ESET、lncRNA GMDS-AS1的表达。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，2-ΔΔCt法计算ESET、lncRNA GMDS-AS1的表达水平。仪器程序设置为：95 ℃，2 min；95 ℃，30 min；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min，41个循环。ESET，正向引物5'-AAGACCAGAAGCTCCGTGAA-3'，反向引物5'-CCTGGGAACTGCTCTTCTTG-3'；lncRNA GMDS-AS1，正向引物5′-AATGCTTTGAGGCCAAGCTA-3′，反向引物5′-TGGGTTCATAAGGGTTGCAT-3′；GAPDH，正向引物5'-GACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'，反向引物5'-GTGGCAGTGATGGCATGGA-3'。

1.2.4 蛋白质印迹法检测ESET、Ki-67、GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白表达 收集细胞或组织匀浆，冰上放射免疫沉淀法裂解30 min，提取总蛋白，测定蛋白浓度，变性。取变性后的蛋白上清做蛋白电泳上样模板。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白电泳结束后，用转膜仪将蛋白从凝胶转移至NC膜，转模环境需在0 ℃以下。使用含2.5%脱脂奶粉的封闭液对膜封闭处理（37 ℃孵育2 h）。洗膜3次，将膜浸入稀释的一抗溶液中（鼠抗ESET（A-1）单抗，1∶800；兔抗Ki-67单抗，1∶1 000；兔抗GLUT-1多抗，1∶1 500；兔抗LDHA单抗，1∶1 000；兔抗C-caspase-3单抗，1∶2 000），4 ℃孵育过夜。充分洗膜，将膜转入稀释的二抗溶液中，37 ℃孵育2 h。洗膜，用ECL发光液显影，曝光。Image J软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白灰度/内参GAPDH的灰度表示蛋白的表达量。

1.2.5 CCK8法检测细胞活性 收集细胞，调至0.5×105个/毫升，取200 μL细胞接种至96孔板，更换新鲜培养液，分别培养24、48、72、96 h。取出培养24、48、72、96 h的各组细胞，向细胞中加入10 μL的CCK8反应液，避光孵育20 min。在490 nm波长下检测细胞吸光度［D（λ）490］。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡 收集细胞，洗涤后用结合缓冲液制成悬液，取500 μL至于反应管，再依次加入Annexin V-FITC（5 μL）、PI（5 μL），避光孵育20 min，上流式细胞仪分析细胞凋亡。总凋亡率（%）=早期凋亡率（%）+晚期凋亡率（%）。

1.2.7 RIP实验检测ESET与lncRNA GMDS-AS1的相互作用 收集细胞，调至1×107个/毫升，取1.0 mL至EP管，用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，加入裂解液冰上裂解。结束后，分别向EP管中加入5 μL异染色质相关小RNA、免疫球蛋白G（IgG）抗体、Argonaute 2蛋白（Ago2）抗体，再加入2.5 μL的RNA酶抑制剂，轻轻吹打混匀。4 ℃低温离心10 min（12 000 r/min），洗涤3次，取上清置于磁珠中，4 ℃孵育过夜。用洗涤液洗涤磁珠3次，将磁珠结合复合物用于qRT-PCR实验。

1.3 统计学方法 实验中的数据均用SPSS 22.0进行专业的统计分析。计量资料使用表示。两组数据比较使用独立样本t检验，多组数据之间的比较使用单因素方差分析联合LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织和癌旁组织中ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1表达的影响 与癌旁组织相比，肝癌组织中ESET的mRNA和蛋白表达均显著升高，lncRNA GMDS-AS1的表达显著降低（P＜0.05），肝癌组织中lncRNA GMDS-AS1的表达与ESET的表达之间呈负相关性，见表1。THLE-2组相比，HepG2组细胞ESET的mRNA和蛋白表达均显著升高，lncRNA GMDS-AS1表达显著降低（P＜0.05），见表2。

表1 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在肝癌组织和癌旁组织的表达/

表1 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在肝癌组织和癌旁组织的表达/

注：ESET mRNA为组蛋白甲基转移酶集合域分叉1微小RNA，lncRNA GMDS-AS1为长链非编码RNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1。

lncRNA GMDS-AS1 1.02±0.31 0.63±0.20 7.57＜0.001组别癌旁组织肝癌组织t值P值例数49 49 ESET mRNA 0.99±0.33 5.18±0.94 29.44＜0.001 ESET蛋白0.23±0.07 0.69±0.14 20.57＜0.001

表2 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在THLE-2、HepG2中的表达/

表2 ESET mRNA和lncRNA GMDS-AS1在THLE-2、HepG2中的表达/

注：ESET mRNA为组蛋白甲基转移酶集合域分叉1微小RNA，lncRNA GMDS-AS1为长链非编码RNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1，ESET为组蛋白甲基转移酶集合域分叉1。

lncRNA GMDS-AS1 1.01±0.13 0.51±0.08 9.83＜0.001组别THLE-2组HepG2组t值P值重复次数9 9 ESET mRNA 1.00±0.17 4.15±0.32 26.08＜0.001 ESET蛋白0.24±0.03 0.67±0.10 12.36＜0.001

2.2 敲减ESET抑制肝癌细胞的增殖 与空载体组相比，敲减ESET组细胞ESET的mRNA和蛋白表达均显著降低，Ki-67蛋白表达显著降低，细胞在48、72、96 h的活性显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 敲减ESET抑制肝癌细胞增殖/

表3 敲减ESET抑制肝癌细胞增殖/

注：ESET为组蛋白甲基转移酶集合域分叉1，Ki-67为细胞增殖抗原标志物。①与空载体组比较，P＜0.05。

组别空白组空载体组敲减ESET组F值P值细胞活性（A490）96 h 0.96±0.10 0.95±0.13 0.77±0.09①8.82 0.001重复次数48 h 0.46±0.08 0.44±0.06 0.32±0.06①11.38＜0.001 ESET mRNA 0.98±0.22 0.96±0.03 0.50±0.24①18.62＜0.001 ESET 9蛋白0.58±0.07 0.60±0.09 0.24±0.04①75.70＜0.001 Ki-67 0.70±0.11 0.69±0.05 0.35±0.11①40.15＜0.001 24 h 0.25±0.04 0.26±0.02 0.24±0.03 0.93 0.408 72 h 0.71±0.13 0.68±0.07 0.46±0.07①18.84＜0.001 9 9 9

2.3 敲减ESET对肝癌细胞糖酵解和凋亡的影响与空载体组相比，敲减ESET组细胞GLUT-1、LDHA的蛋白表达均显著降低，C-caspase-3蛋白表达显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。见表4，图1。

图1 敲减组蛋白甲基转移酶集合域分叉1（ESET）的肝癌细胞凋亡图及GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白表达：A为肝癌细胞的凋亡图；B为GLUT-1、LDHA和C-caspase-3的蛋白图

表4 敲减ESET对肝癌细胞糖酵解和凋亡的影响/

表4 敲减ESET对肝癌细胞糖酵解和凋亡的影响/

注：ESET为组蛋白甲基转移酶集合域分叉1，GLUT-1为葡萄糖转运蛋白1，LDHA为乳酸脱氢酶A，C-caspase-3为活化胱天蛋白酶-3。①与空载体组比较，P＜0.05。

组别空白组空载体组敲减ESET组F值P值凋亡率/%4.19±0.59 3.74±0.51 14.41±1.5①329.97＜0.001重复次数9 9 9 GLUT-1 0.66±0.04 0.64±0.08 0.47±0.10①16.35＜0.001 LDHA 0.72±0.13 0.76±0.05 0.43±0.10①29.79＜0.001 C-caspase-3 0.25±0.04 0.27±0.02 0.45±0.18①9.53 0.001

2.4 过表达lncRNA GMDS-AS1对肝癌细胞增殖的影响 与空载体组相比，过表达lncRNA GMDSAS1组细胞lncRNA GMDS-AS1的表达显著升高，Ki-67蛋白表达显著降低，在48、72、96 h的活性显著降低（P＜0.05）。见表5。

表5 过表达lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌细胞的增殖/

表5 过表达lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌细胞的增殖/

注：lncRNA GMDS-AS1为长链非编码RNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1，Ki-67为细胞增殖抗原标志物。①与空载体组比较，P＜0.05。

组别空白组空载体组过表达lncRNA GMDS-AS1组F值P值细胞活性（A490）96 h 1.03±0.11 0.98±0.12 0.72±0.08①22.73 0.001重复次数48 h 0.45±0.08 0.46±0.06 0.34±0.06①8.80＜0.001 lncRNA GMDS-AS1 1.00±0.14 1.10±0.09 5.19±0.43①725.89＜0.001 Ki-67 0.65±0.09 0.63±0.08 0.42±0.06①24.25＜0.001 24 h 0.29±0.04 0.28±0.05 0.27±0.03 0.54 0.590 72 h 0.68±0.09 0.65±0.08 0.47±0.07①17.95＜0.001 9 9 9

2.5 过表达lncRNA GMDS-AS1对肝癌细胞糖酵解和凋亡的影响 与空载体组相比，过表达lncRNA GMDS-AS1组细胞GLUT-1、LDHA的蛋白表达均显著降低，C-caspase-3蛋白表达显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。见表6，图2。

图2 过表达长链非编码RNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1（lncRNA GMDS-AS1）的肝癌细胞凋亡图及GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白表达：A为过表达lncRNA GMDS-AS1的肝癌细胞凋亡图；B为GLUT-1、LDHA、C-caspase-3的蛋白图

表6 过表达lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌细胞糖酵解、诱导细胞凋亡/

表6 过表达lncRNA GMDS-AS1抑制肝癌细胞糖酵解、诱导细胞凋亡/

注：lncRNA GMDS-AS1为长链非编码RNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1，GLUT-1为葡萄糖转运蛋白1，LDHA为乳酸脱氢酶A，C-caspase-3为活化胱天蛋白酶-3。①与空载体组比较，P＜0.05。

凋亡率/%3.89±0.84 3.92±0.86 14.67±1.94①200.23＜0.001组别空白组空载体组过表达lncRNA GMDS-AS1组F值P值重复次数9 9 9 GLUT-1 0.61±0.04 0.60±0.08 0.42±0.10①17.15＜0.001 LDHA 0.74±0.11 0.75±0.09 0.43±0.07①35.61＜0.001 C-caspase-3 0.21±0.04 0.23±0.05 0.49±0.08①62.74 0.001

2.6 ESET与lncRNA GMDS-AS1的结合 与空载体组相比，过表达ESET组Ago2抗体的细胞中lncRNA GMDS-AS1表达显著升高（P＜0.05）。见表7。

表7 RIP实验结果/

表7 RIP实验结果/

注：RIP为RNA结合蛋白免疫沉淀，lncRNA GMDS-AS1为长链非编码RNA甘露糖4，6-脱水酶反义RNA1，IgG为免疫球蛋白G，Ago2为Argonaute 2蛋白，Input为异染色质，ESET为组蛋白甲基转移酶集合域分叉1。

Input 8.84±0.39 8.79±0.92 0.15 0.883组别空载体组过表达ESET组t值P值重复次数Ago2 2.14±0.21 4.97±0.52 15.14＜0.001 lncRNA GMDS-AS1 IgG 0.89±0.10 0.91±0.13 0.37 0.719 9 9

3 讨论

ESET是人类肝癌中表达上调最显著的表观遗传调节因子，ESET的上调与肝癌病人的转移形成、预后较差密切相关［8-9］。近期，Shao等［10］在肝癌的研究中报道，ESET在肝癌组织和细胞中低表达，作为miR-621的下游靶基因调控肝癌的放射敏感性，揭示miR-621/ESET通路通过激活p53信号通路的活性提高肝癌细胞的放射敏感性。本研究发现，ESET在肝癌组织中的表达异常升高，并且敲减ESET具有抑制肝癌细胞增殖、糖酵解，促进凋亡的作用，这均与前人的研究相呼应。但是ESET发挥致癌作用的潜在机制仍需继续研究。此研究还发现了lncRNA GMDS-AS1在肝癌组织中的表达与ESET的表达具有明显的负相关性，于是猜测ESET在肝癌细胞中的作用可能与lncRNA GMDS-AS1有一定关系。

lncRNA已被证明是癌症进展的重要调节因子，包括肝细胞癌［11-12］。lncRNA DEAD/H盒蛋白11反义RNA 1调控肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、糖代谢和凋亡过程［13］。lncRNA远端同源框6反义RNA1（lncRNA DLX6-AS1）的沉默，可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡的发生［14］。但是，lncRNA GMDS-AS1在肝癌中的作用仍有待进一步研究。Zhao等［15］在肺腺癌的研究中发现新的失调lncRNA，lncRNA GMDS-AS1作为肿瘤抑制基因在肺腺癌中低表达，过表达lncRNA GMDS-AS1能够在体内外抑制癌细胞的增殖并促进凋亡；深入研究还发现，GMDS-AS1是miR-96-5p的靶基因，GMDS-AS1与miR-96-5p相关，调节LUAD细胞的增殖和凋亡，说明lncRNA GMDS-AS1作为肺腺癌治疗的潜在靶点的前景。但是，lncRNA GMDS-AS1作为新发现的癌症调控因子，其在肝癌中的功能尚未有人研究。本研究使用qRT-PCR实验检测了肝癌组织和癌旁组织中lncRNA GMDS-AS1的表达发现，lncRNA GMDS-AS1在肝癌组织中表达下调，这与Zhao在肺腺癌中的研究结果相吻合［16］。进一步研究，通过构建过表达lncRNA GMDS-AS1的肝癌细胞，检测细胞增殖、凋亡、糖酵解发现，过表达lncRNA GMDS-AS1抑制了癌细胞的增殖、糖酵解，促进癌细胞的凋亡，说明lncRNA GMDS-AS1在肝癌中也扮演抑癌基因的角色［17］。此研究还通过RIP实验发现，ESET与lncRNA GMDS-AS1之间存在结合力［18］。

综上所述，甲基转移酶ESET促进肝癌细胞的增殖、糖酵解，抑制凋亡，发挥促进癌症恶化的作用，产生这种作用的潜在机制与负向调节抑癌因子lncRNA GMDS-AS1相关，为肝癌的精准治疗提供新靶点。