宏基因组二代测序技术对腹部创伤合并腹腔感染的诊断价值

邓云烜,丁威威,刘宝晨,杨 超,解廷斌

南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)普通外科研究所,南京 210000

腹腔感染(intra-abdominal infection,IAI)是腹部创伤治疗中的关键问题,其挑战性来源于病原体的多样性、耐药性增加以及患者的复杂生理反应[1]。据统计,IAI是腹部创伤患者晚期死亡的主要原因[2],因此早期诊断与干预有助于改善患者预后。

IAI患者通常会接受预防性或治疗性的抗生素使用,腹腔及血液样本中的病原体数量往往偏低,因此直接涂片镜检不适用;其次,由于许多病原体的抗原存在变异,缺乏特异性的检测抗体对其进行识别,血清学检测方法应用有限[3];而分子生物学诊断方法虽然可从基因水平上对病原体进行鉴定,但由于腹腔感染的病原体种类繁多且构成不确定,预设感染病原体进行验证性诊断无法确保诊断的全面性,因此适用性不强[4]。现阶段,临床应用最为广泛的仍然是微生物培养方法,也是感染诊断的金标准,培养得到的菌株可以进行生化反应、药敏试验等进一步分析,为临床提供有价值的信息,但培养方法的周期长,且受限于样本质量(微生物数量及类别),阳性率往往偏低。因此,亟需一种不依赖于微生物表型的检验技术以提高病原体诊断效率。

近年来,宏基因组二代测序(meta-genomic next-generation sequencing,mNGS)作为新兴的微生物鉴定和传染病诊断技术,以其快速、高效、无偏检测微生物的优势,已广泛应用于临床感染性疾病的诊疗[5]。在符合推荐适应证的情况下,mNGS对不同感染性疾病的诊断价值存在差异[6],但其在腹部创伤合并IAI的诊疗中仍具有较大潜在价值。因此,本研究旨在描述mNGS对腹部创伤合并IAI诊疗的影响并评估其临床诊断价值。

资料与方法

1 纳入与排除标准

本研究回顾分析2020年8月—2022年4月收住南京大学医学院附属金陵医院普通外科ICU的腹部创伤疑似合并IAI的患者110例。纳入标准:(1)年龄≥18岁的腹部创伤患者,简明损伤定级标准(abbreviated injury scale,AIS)评分≥3分;(2)根据临床表现、影像学及实验室检查诊断为疑似/存在IAI,且病情较危重,符合《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》(下文简称共识)[7]中所推荐的临床适应证;(3)样本:通过局部穿刺、手术或腹腔引流管留取腹腔引流液(peritoneal drainage,PD)样本,同时留取外周静脉血样本;(4)检测方法:同时进行血液及PD微生物培养与mNGS。排除标准:(1)病例资料缺失;(2)合并严重颅脑损伤(头部AIS评分≥3分)。疑似IAI诊断标准:病史、查体、实验室检查、影像学检查及穿刺等[8]。确诊依赖于阳性病原学检测结果。收集患者的人口学资料及临床基线参数,包括损伤情况、感染诊断、血液炎症指标、mNGS和微生物培养的检测结果以及治疗调整情况。患者均已签署知情同意书,本研究已通过医院医学伦理委员会批准(2020NZKY-011-01)。

2 样本检测

收集的标本在采集后4h内送至临床微生物实验室进行微生物培养。将同时留取的另一份标本置于干冰保存进行mNGS检测。使用QIAamp DNA微量试剂盒(凯杰,希尔登,德国)从样本中提取DNA,然后以QIAseq超低输入文库试剂盒(Illumina,加利福尼亚州,美国)构建DNA文库;使用Qubit(赛默飞世尔,马萨诸塞州,美国)和安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技,马萨诸塞州,美国)评估文库质量,高质量文库在NextSeq 500平台(Illumina,加利福尼亚州,美国)上进行循环测序,每个循环均设阴性和阳性对照。之后进行数据分析,去除较短或低质量的序列,并与人类参考基因数据库(hg38)对比后,进一步过滤人源DNA,最终剩余的序列与美国国家生物信息中心微生物基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes)进行比对。

3 感染性病原体的定义

感染性病原体为文献报道的具有致病性的微生物,并且致病特点与临床症状相符,并排除污染。由于病毒和支原体不是常见的IAI病原体,本研究不包括mNGS检测到的病毒和支原体。如果测定细菌或真菌满足以下mNGS阈值之一,则判定为阳性:(1)细菌或真菌的相对丰度>30%;(2)组织病理学检查和(或)微生物培养阳性;(3)血液及PD均检测到符合致病特点的病原体;(4)单种细菌>50个特异序列,单种真菌>1个特异序列。

4 统计学分析

结 果

1 患者纳入及临床资料

根据纳入标准,共有43例严重腹部创伤存在/疑似合并IAI患者纳入研究,其中4例因临床资料不完整被排除,2例因存在严重颅脑损伤被排除,最终纳入37例。根据微生物培养以及mNGS检测结果,最终确诊IAI患者32例,非IAI患者5例(图1)。患者的人口学及临床资料比较见表 1。IAI组中,患者的损伤严重程度较高,ISS为19(14,27)分,取检时间为13(7,24)d,感染原因的前三位依次为肠瘘(n=11)、腹腔残余感染(n=10)及胰腺周围组织感染(n=7)。IAI组与非IAI组相比,取检时间更长,APACHE II评分更高,ICU住院时间更长,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

SICU:外科重症监护室;AIS:简明损伤定级标准;PD:腹腔引流液;IAI:腹腔感染

表1 纳入患者的人口学及临床资料比较[M(P25,P75),n]

2 不同检测方法的诊断效能比较

笔者对四种检测方法的诊断性能进行评估,包括PD微生物培养、PD mNGS、血液微生物培养及血液mNGS。对于阳性结果报告时间,mNGS较微生物培养显著缩短(22.0hvs.61.5h,P<0.05),见图2。在诊断IAI方面,PD mNGS显示出较高的灵敏度及阴性预测值(均为1.000),微生物培养仅为0.343及0.192,但PD mNGS特异度(0.600)及阳性预测值(0.941)低于PD微生物培养,特异度差异有统计学意义(P<0.05,表2),两种方法诊断IAI的受试者工作曲线(receiver operating curve,ROC)的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.800及0.672(P<0.05),见图3。血液微生物培养的阳性预测值及特异度均为1.000,阴性预测值为0.147,灵敏度为0.094。血液mNGS的阳性预测值为0.964,诊断特异度为0.800,与血液微生物培养无明显差异(P>0.05);阴性预测值为0.444,灵敏度为0.843,均高于血液微生物培养方法,其中灵敏度差异有统计学意义(P<0.05),两种方法诊断IAI的ROC的AUC分别为0.822及0.547(P<0.05)。

mNGS:宏基因组二代测序;****P<0.001

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因组二代测序;IAI:腹腔感染;ROC:受试者工作曲线

表2 不同检测方法对IAI诊断效能的比较(95%CI)

3 IAI患者的病原学结果分析

对32例确诊IAI患者的微生物培养及mNGS检出病原体进行分析,血液及PD mNGS病原体的检出率分别为75.0%(24/32)及90.6%(29/32),均显著高于微生物培养。且检出病原体类别多于微生物培养,去除对IAI意义不明的病毒以及支原体后,共检出革兰氏阴性菌36种,革兰氏阳性菌11种,真菌10种,检出率前三的革兰氏阴性菌依次为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及大肠埃希菌,检出率最高的革兰氏阳性菌为肠球菌属,真菌为念珠菌属。在两种样本中,mNGS对各病原体的检出率均高于或等于培养方法,血液样本中,肺炎克雷伯菌差异具有统计学意义(P<0.05),PD样本中,肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌差异具有统计学意义(P<0.05),见图4。

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因组二代测序

根据阳性病原体的诊断标准对检测结果进行分析,确定可能的致病微生物构成,mNGS对革兰氏阳性菌的检出率为46.9%(15/32),对真菌的检出率为43.8%(14/32),对多病原体的混合感染检出率为84.4%(27/32),均显著高于微生物培养方法(28.1%,P<0.05)。见图5。

mNGS:宏基因组二代测序;*P<0.05,***P=0.001

4 mNGS代表性病例

在病例3中,患者PD呈现明显脓性,mNGS结果中星座链球菌未达阳性标准,栖牙普雷沃菌为口腔定植菌,无引起IAI相关报道。因此,PD微生物培养更符合患者病史及临床表现,mNGS出现假阳性结果可能与取检不规范或不一致有关。在病例32中,患者存在发热及腹腔积液,PD及血液mNGS均检出大量厌氧菌,并非IAI常见致病菌,同时,正常人血液中含有少量厌氧菌核酸,因此判断患者并非IAI。在病例37中,PD mNGS显示存在多种病原体,其中只有铜绿假单胞菌相对丰度>30.0%,血液mNGS检出的鸟肠球菌特异序列数偏低,同时由于患者胰周感染严重,因此认为铜绿假单胞菌及屎肠球菌为责任微生物。

在病例15中,患者腹部术后反复高热,且存在高位脊柱损伤,自主呼吸无力,疑似感染源为腹腔及呼吸系统,进行血液及PD mNGS检测发现,血液中存在鲍曼不动杆菌,PD中存在序列数较少的肠道细菌,后续肺泡灌洗液微生物培养也提示存在大量鲍曼不动杆菌,因此排除IAI,针对肺部感染强化治疗。在病例18中,患者为腹部受击后不明原因引起的腹膜后脓肿,术中PD及外周血mNGS提示存在大量鱼腥味锥形杆菌,查阅资料知该菌为口腔致病菌,产硫化氢,与术中脓腔大量恶臭脓液相符,进一步检查患者口腔发现存在较多龋齿且入院前一周有过高热,因此推断患者为免疫低下致血行感染而继发后腹膜血肿感染。见表3。

表3 部分代表性病例病原学信息

讨 论

严重创伤导致机体生理功能紊乱和免疫机能下降,随着病原体暴露风险的增加,感染发生率较高[9]。据统计,腹部创伤患者晚期死亡的主要原因为IAI[1]。因此,对感染早期识别与针对性治疗,对改善患者的预后至关重要,同时凸显了病原体鉴定技术在感染诊疗中的关键作用。

在目前临床常用的微生物检测方法中,血清学检验存在交叉反应和抗原变异的问题,荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)需要预设病原体类别进行筛选,涂片镜检则缺乏特异性。因此,微生物培养仍然是IAI临床诊疗中应用最广泛的微生物分离鉴定技术,但存在阳性率低、时效性差等问题[10],限制了抗生素的合理使用。

本研究显示,与微生物培养相比,mNGS的结果反馈时间短,诊断时效性更强。同时,mNGS受预先抗生素使用的影响较小,对IAI的识别能力显著优于微生物培养。此外,mNGS识别病原体的种类及数目显著多于微生物培养,与本研究结果一致,其无偏检测病原体的特性使其对混合感染的识别能力较强[5],其中真菌、革兰氏阳性菌等类别病原体的检出对指导抗生素使用具有重要价值。

既往研究显示,临床血液微生物培养阳性百分比呈下降趋势,阳性率最低至9.9%[11],本研究中血液微生物培养阳性率仅为9.4%(3/32),这可能是由于大部分患者已预先使用广谱抗生素,降低了血液中病原体的数量。Miao等[12]发现抗生素使用对mNGS结果影响较小,表明致病微生物的核酸可在患者血液中留存更长的时间。在本研究中,血液mNGS显示出更高的阳性率(28/32,87.5%)和较好的诊断性能,在预先抗生素使用的情况下,即便是常规容易微生物培养的病原体,mNGS仍然具有更强的检测能力。因此,对于抗生素使用时间较长的感染患者,mNGS是一种较为理想的选择。

虽然PD和血液mNGS均显示出较高的诊断灵敏度,但mNGS的结果解读仍然存在困难[7]。在IAI中,多病原体及罕见病原体的检出十分普遍,如何判断它们对感染的贡献是目前该技术临床应用的一大难点[5,7]。2021年一项多中心回顾性队列研究显示,82例血液mNGS阳性率虽达到61%,但仅在7.3%的病例中产生了积极影响。说明当检出结果不足以对现有治疗产生影响,以及无法完全明确检出结果是否疾病驱动因素时,该技术的临床价值有限[6]。2021年初发布的中国专家共识也指出了这一问题,并对相关概念、适应证及检测流程进行了规范,但因实验室及疾病差异,并未对阳性阈值做出明确推荐[7],因此仍需要更多元的研究进一步积累相关数据。共识也指出,对于核酸提取破壁困难的如真菌(如曲霉菌、毛霉菌、隐球菌等),即使特异序列数较少也应当考虑为致病菌,并进行三方验证[7]。本研究中对于多病原体同时存在的情况,依据文献中较多使用的标准对相对丰度低(<30%)、特异序列数少(<50个)、临床致病性不明确及潜在污染病原体(如表皮葡萄球菌、部分单胞菌属等)予以去除[13],同时针对本中心患者病程特点,将真菌阳性标准进行了放宽(>1个特异序列数)。目前有部分研究通过微生物引起的特异性免疫反应与细胞因子变化,或是代谢物分析、生物信息学分析和微生物组分析来探究致病微生物所引起的特异性改变,以区分致病与定植、污染微生物,提高诊断准确性,但尚需要相关的临床研究来表明其实际区分能力[14-15]。

由于病情及评价标准的差异,目前对mNGS临床获益的研究结果不一[6,16]。在本研究中,将病原体检测结果进行评估筛选后,对现有抗生素抗菌谱覆盖不足的病例进行了调整;但对于检出窄谱病原体的病例,考虑到治疗风险,在患者感染源及感染症状未充分控制前,并未进行相应的调整。而对于医院常见病原体的检出,在综合患者病史、临床表现及抗感染治疗反应等信息后,笔者对细菌耐药性进行了推断,并在此基础上进行不同抗菌活性抗生素的调整。虽然目前部分mNGS报告中增加了对耐药基因信息的描述,但基因定位和表型存在等问题尚未完全解决,因此仅能作为参考,具体推断仍需结合临床。

本研究也存在一些不足。首先,微生物培养和mNGS都缺乏客观的标准来确定检测到的致病微生物是来自感染、定殖还是污染,而是依赖于临床医师的主观判断,这在结果解释性上存在不足。其次,研究没有在基因水平上用额外的分子方法进行验证。第三,研究为单中心回顾性研究,数据有限且积累不受研究者控制而存在偏倚。

本研究显示,对于腹部创伤合并IAI的患者,mNGS的总体诊断性能优于微生物培养方法,且在诊断混合感染及罕见病原体感染方面具有独特的优势,随着技术的成熟与成本的降低,有望改变现有IAI的诊疗范式,促进个体化的精准治疗。未来需进一步的前瞻性研究表明mNGS的临床价值。

作者贡献声明：邓云烜:研究构思及设计、文献调研;数据收集、整理、分析及文章撰写;丁威威、刘宝晨:研究构思及设计;杨超:文章修改和审查;解廷斌:结果解释