进口萨福克冷冻胚胎移植及受体同期发情技术研究*

党鹏程，陈 祥，熬 政，王智鹏，刘长彬，倪建宏，卢守亮，张振良

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.新疆生产建设兵团第十师一八八团；3.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所）

胚胎移植又称为借腹怀胎，亦称为受精卵移植，是通过超数排卵技术获得优良母畜的早期胚胎（囊胚、桑椹胚或二细胞受精卵），同时对受体母畜进行同期发情处理，使供受体母羊处于发情期的同一阶段，然后将早期胚胎移植到生理状态相同的受体母畜子宫内，使之继续发育成独立个体的生物繁殖技术应用[1-2]。胚胎移植技术最早出现在英国剑桥大学的Walter Heape 教授，他在1890年使比利时母兔成功生产出安哥拉仔兔，该技术引起了国际上的广泛关注[3]。随后，胚胎移植技术在动物繁殖中得到快速推广，特别是在绵羊、奶牛、山羊、猪、鼠等动物中快速扩繁种群以及优良种畜的跨地域、跨国际间的流通方面起到了举足轻重的作用。

我国动物胚胎移植技术的研究起步较晚，在20世纪50～60年代，我国的胚胎移植技术一直处在研究开发阶段。直至20世纪70～80年代期间，胚胎移植技术才逐步在猪、马、牛、羊等物种上取得成功，并进行推广应用[4-5]。本文从进口胚胎移植中的影响因素开展了相关的应用研究，总结出了在相同的环境、饲养和管理条件、受体状态等因素下，技术人员的移植技术水平是影响移植成功率的重要因素，特别是受体羊子宫角在体外滞留时间，技术人员在控制子宫角的力度和方向以及子宫角钝性打孔时的出血与否等等是直接影响受体羊受胎率的关键因素。为今后一段时间内绵羊胚胎的移植提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验羊

受体的选择标准为：受体羊健康、无繁殖性疾病和胎衣不下，无不良遗传或传染性疾病，母性好，泌乳量高，体型稍大，年龄2.5～5.0岁，经产羊1～2胎为宜。

1.1.2 试验药品

孕马血清1 000 IU∕支（宁波市三生药业有限公司）；CIDR栓50个∕包，45 mg∕个（北京燕瑞生物股份有限公司）；PGF2a0.2 mg∕支，2 mL∕支（宁波第二激素厂生产）；胚胎解冻液和胚胎保存液（美国ICP 公司生产）；静松灵10 mL∕支（丹东市兽药厂）；75%酒精500 mL∕瓶（德州利兴消毒制品有限公司）和碘伏500 mL∕瓶（山东利尔康股份有限公司）；青霉素G粉针160万IU（江西省可大动物药业有限公司）。

1.1.3 试验设备

恒温水浴锅4孔（上海精宏实验设备有限公司，DK-8D）；腹腔镜及其胚胎设备（Germany Wolf Laparoscopic，Henke Sass Wolf）；体式显微镜（日本尼康公司）；外科器械（上海金钟医疗器械有限公司）；B超仪（Tringa Linear Vet，意大利百胜集团荷兰公司）；羊用子宫角打孔器（专利号：ZL2015 2 0272750.4）；移植针（美国ICP公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 同期发情处理方案

随机筛选400只受体母羊，“两病”检测全部为阴性，分组进行PGF2a颈部肌肉注射，剂量为1 mL（0.1 mg）∕只，补饲胡萝卜或亚硒酸钠维生素E灌服。7 d后阴道放置CIDR栓，记为0 d；埋置CIDR栓后13 d，撤出CIDR栓，颈部肌肉注射PMSG 330～450 IU或PGF2a0.1 mg∕mL；试情公羊试情，36～48 h羊群出现发情记为0 h，记为15 d；从发情开始计算，发情后第5 d受体羊需要断食限水，补饲一定量（200 g∕只）的全价精饲料；于发情后的6 d，即可进行胚胎移植技术操作。

1.2.2 胚胎移植技术步骤

第一步，将空腹、断水和补饲精料的受体母羊，固定在手术架上，用肥皂水呈扇形打湿乳房基部前3～10 cm处羊毛，用刮毛刀将羊毛全部剃除干净。第二步，使用喷壶将剪毛部位喷洒碘酒消毒，待30 s后，使用酒精喷壶，喷洒碘酒部位进行脱碘，待30 s后，再用消毒棉球或纱布，由内向外旋转擦干剪毛（手术）部位。第三步，选择血管较少的部位，使用腹腔镜打孔器错位打孔，避免出血，通过光源探查对侧腹壁手术部位的血管分布，避开血管，使用手术刀片，切开一个切口，切口长约1.0～1.5 cm。此时，使用子宫钳夹住子宫角小弯处，轻轻拉出腹壁外，使用子宫角打孔器，选择子宫角分布的毛细血管间隙打孔，避免子宫角出血。第四步，将装好胚胎的移植针对准子宫角移植孔，插入子宫角内约2～3 cm深，迅速地将胚胎推送至子宫角小弯处，完成胚胎移植过程。第五步，将腹壁切口缝合1针，打结，缝合后在切口处涂抹土霉素软膏或喷洒碘酒进行消毒处理。刚刚移植后的受体母羊需要休息2 h后再进行适量的饮水和采食优质干草，并补饲一定量的全价精饲料以及胡萝卜等。

1.2.3 进口胚胎质量分级鉴定标准

胚胎质量分级评定标准详见表1。

表1 胚胎质量分级评定标准[6]

2 结果与分析

2.1 进口萨福克冷冻胚胎质量鉴定

依据胚胎质量鉴定标准，A、B级胚胎在移植后，因胚胎质量不同，受体羊子宫所产生的信号也不同，因此受胎率明显高于C级胚胎。所以在生产胚胎时，除了考虑激素类药品的品质和剂量、处理程序、膘情和品种等，还应考虑供体的饲料是否均衡和供应充足[7]。由表2可知，A级胚胎平均占比为45%～47%，B级胚胎平均占比为35%～36%，C级胚胎平均占比为13%～16%。基本达到了胚胎商业化利用的胚胎质量水平。C级胚胎严格来说是不能作为商业化胚胎出口的，胚胎质量主要体现在透明带裂痕或破损、内细胞团松散等，C级胚胎的产生可能与胚胎冷冻后的冷冻损伤有关。

表2 进口胚胎不同级别占比

2.2 同期发情技术分组试验结果

将425只相同品种的受体母羊随机分为4组，采用相同的同期发情处理方法，检验同期发情技术的处理效果。从表3中可以看出，受体羊发情率平均为88%～95%，移植率为82%～88%。受体羊使用率达到同期发情处理的结果，各组之间差异不显著（P＞0.05）。

表3 受体羊同期发情技术处理效果

2.3 进口萨福克冷冻胚胎移植效果

为了提高进口萨福克肉羊冷冻胚胎移植的受胎率，对胚胎等级进来了严格分级，将C级胚胎与A、B级胚胎搭配移植。同时革新子宫角打孔技术和减少子宫角接触性刺激等措施，大大提高了冷冻胚胎的移植受胎率。从表4可以看出，四组的受胎率分别为58.10%、73.17%、48.81%和41.76%，1、3、4组受胎率与2组相比，差异极显著（P＜0.01）；1组与2、4组相比，受胎率差异显著（P＜0.05）。平均受胎率为55.46%。

表4 进口冷冻萨福克肉羊胚胎移植数及受胎率

3 讨论与结论

进口萨福克肉羊冷冻胚胎的质量是影响受胎率的关键因素之一，在相同的饲养、管理、移植技术和移植的胚胎数量等条件下，A级胚胎的受胎率明显高于B级和C级胚胎[7-8]。鲜胚、双胚和A级胚胎的受胎率要高于冻胚、单胚和B∕C级胚胎，这是胚胎移植行业的普遍共识。再者，技术人员的胚胎移植技术熟练程度，特别是移植手法的轻重和子宫角打孔时的出血与否，也是影响受胎率的关键因素之一，这与S.Papadopoulos的研究结果一致[9-11]。研究表明，在胚胎的质量方面，随着胚胎质量的下降如A级降到B级再降到C级，所表现出来的受胎率也呈下降趋势，说明了胚胎的质量越高，越能够快速适应受体羊的子宫内环境，并快速的孵化与继续发育，最终完成胚胎着床这一生理过程，这与F.Baria的公开报道一致[12-13]。

受体羊所处的发情阶段也会对胚胎移植的受胎率产生一定的影响。受体羊在同期发情处理后相对集中在撤栓后的36 h左右出现发情，通过试情公羊进行试情，并用不同的标记符号进行相应的标注，严格受体羊的发情时间，基本确定受体羊的排卵时间。在移植过程中，需要解冻2～3管冷冻胚胎，在实体显微镜下对解冻后的胚胎进行鉴定，并对胚胎进行严格分级，确定胚胎的胎龄。将胚胎装移植针后，移植给与胚胎相对应子宫内环境相同的受体羊，以保障受体羊能够获得较高的受胎率[14-16]。

胚胎移植是一个系统工程，包括了供体羊筛选、供体羊处理程序、供体羊品种、FSH总注射剂量、FSH批次和品牌、PMSG或PGF2a批次与用量和品牌、供体羊激素组合（海绵栓+PMSG或PGF2a+LH、CIDR+PMSG或PGF2a+LH）、受体羊筛选、受体羊品种、受体羊处理程序、受体羊激素组合（海绵栓+PMSG或PGF2a、CIDR+PMSG或PGF2a）、供体羊激素的注射部位、超排和移植的季节、气候变化、营养状况、饲养方式（放牧和圈养）、技术水平等17个关键技术环节，任何一个技术环节考虑不充分的话，都可能会影响到胚胎移植的最终受胎率。