固定化β-葡萄糖苷酶在安梨皮渣果酒、果醋中的增香作用

陈颖，丁舒，张越，崔瀚元，陈晓明，张峻

（天津市农业科学院 农产品保鲜与加工技术研究所，天津 300384）

安梨，俗称“酸梨”，是秋子梨系统中的一个重要品种，主要分布在京津冀地区及辽宁省西部[1-4]。安梨对肝和肺有利，有消炎、利尿、润喉、止咳、降血压、解酒等药用价值[5-7]。由于安梨果实有机酸含量丰富，导致其口感偏酸，不适宜鲜食。安梨主产地目前主要以初加工为主，附加值较低，并且生产过程中产生的安梨皮渣等下脚料，约占安梨果实的30%，给周围环境带来一定的威胁。安梨皮渣中富含多酚、黄酮等生物活性成分，具有抗癌、抗辐射等多种抗氧化功能，若能加以利用不仅可以提高安梨加工制品的附加值，还可以实现废弃物综合利用，对于生态环境的保护具有重要意义。

与粮食醋相比，果醋因具有水果芳香并且口感柔和而拥有广泛的市场前景。果醋风味是评价果醋品质的一个重要指标。由于果醋生产过程较长，易造成芳香成分的损失，从而影响果醋品质。β-葡萄糖苷酶因其在果汁、果酒中具有改善风味品质的作用近年来备受关注，而酶的固定化处理可以提高酶的使用效率、降低使用成本[8]。本文以安梨皮渣为原料，添加固定化β-葡萄糖苷酶酶解后进行酒精发酵、醋酸菌发酵，并通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 法联用分析比较醋酸发酵前后以及陈酿后安梨皮渣醋中主要芳香物质的变化，从而为工业化生产安梨皮渣果醋提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

安梨：采摘自天津蓟州区。β-葡萄糖苷酶（100 U/g，食品级）：江苏锐阳生物科技有限公司；对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；果胶酶（30 000 U/g，食品级）：上海康禧食品饮业有限公司；白砂糖（食品级）：上海上棠食品有限公司；酵母（食品级）：安琪酵母有限公司；醋酸菌（沪酿1.01）：天津农科院农产品加工实验室自行保藏；焦亚硫酸钾（食品级）：安徽中弘生物工程有限公司；葡萄糖（食品级）：吴江市腾鸿化工科技有限公司；酵母粉（化学纯）：西安拉维亚生物科技有限公司；2-辛醇（分析纯）：Sigma-Aldrich 公司；氯化钠（化学纯）：天津大学科威新材料科技开发公司。

1.2 仪器与设备

贝尔斯顿螺旋压汁机（ZZJ8020D）：德国贝尔斯顿科技有限公司；生化培养箱（LRH-70F）：上海一恒科学仪器有限公司；双光束紫外可见分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发器（RE52CS）：上海亚荣生化仪器厂；气相色谱仪（Trace1300）、质谱仪（ISQ7000）：赛默飞世尔科技公司；极性萃取头（50/30 μm PDMS 型）：美国SUPELCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 安梨皮渣醋制备

1.3.1.1 酿造工艺

安梨→清洗→破碎、打浆→安梨皮渣→固定化β-葡萄糖苷酶、果胶酶酶解→成分调整→酵母发酵→过滤→安梨皮渣酒→醋酸菌发酵→过滤→陈酿。

1.3.1.2 操作要点

1）原料挑选

挑选新鲜无病虫害、霉变和机械损伤的安梨。

2）磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶的制备

交联酶聚集体：用水配制β-葡萄糖苷酶溶液1 mL，其蛋白含量为10 mg/mL，逐步加入0.08 g 的聚乙烯亚胺（polyvinylimide，PEI）和0.25 g 的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000，搅拌或振荡，使PEI 和PEG6000溶解并混匀，所得混合物作为含有酶的分散相。于20 mL 大豆油中加入0.2 g 的司班60，混匀后将其加入到上述含有酶的分散相中，1 500 r/min 搅拌乳化1 min，形成油包水乳液，然后加入20 μL、25%的戊二醛，1 500 r/min 搅拌5 min，25 ℃静置交联2 h。交联结束后，乳液于3 000 r/min 离心20 min，所得沉淀以蒸馏水离心清洗3 次后，即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体[9-11]。

磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶：将1 mL 所得交联β-葡萄糖苷酶聚集体悬浮液与一定量海藻酸钠水溶液和0.02 g 的Fe3O4磁粉混合，得4 mL 混合物，混合物中海藻酸钠终浓度为2%（质量分数）。将混合物用注射器逐滴加入到40 mL、质量分数3%的氯化钙溶液中，磁力搅拌，待微球成形后静置固化1 h，用蒸馏水清洗，即得磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶，利用外部磁场分离回收。

3）酶解

安梨皮渣中加入1.5 倍质量的水、0.02%的果胶酶和100 U/g 的磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶，于40 ℃下酶解24 h。

4）成分调整

皮渣酶解后冷却至室温，用蔗糖调整发酵液的可溶性固形物为19%～20%，加入0.01%焦亚硫酸钾。

5）酵母活化

称取一定量的酵母，用质量分数5%的蔗糖溶液复水活化30 min。

6）酒精发酵

安梨皮渣中加入1.5 倍质量的水，加入0.02%的果胶酶和固定化β-葡萄糖苷酶（酶活回收率为51%，加酶量100 U/g）进行酶解，酶解温度40 ℃，酶解时间24 h。酶解结束后，用蔗糖调整皮渣酶解液的可溶性固形物为19%～20%，加入0.01%焦亚硫酸钾，接种0.05%活化酵母菌，28 ℃条件下静置发酵，每隔24 h 检测发酵液的可溶性固形物、总酸和酒精度。另取不加固定化β-葡萄糖苷酶的记为对照皮渣酒，发酵结束后进行固相微萃取与GC-MS 分析。

7）醋酸菌发酵剂的制备

按照SB/T 10307—1999《液态深层发酵酿醋工艺规程》（附录B）的方法对沪酿1.01 醋酸菌进行斜面试管菌种培养以及液体扩大培养，获得醋酸菌液体菌种，4 000 r/min 的转速，离心15 min，收集菌体，将所收集的菌体用无菌水洗涤后，得到醋酸菌菌泥。将醋酸菌菌泥与保护剂溶液按照1∶3 的质量比混合均匀，冷冻干燥，即得冻干醋酸菌发酵剂。保护剂溶液为可溶性固形物为200 g/L 左右的海藻糖浆溶液（海藻糖含量≥60%），120 ℃灭菌15 min 后使用。

8）醋酸发酵

上述步骤6） 皮渣酒发酵至酒精度为6.7% vol、总酸含量为5.4 g/L（以柠檬酸计）时添加醋酸菌进行醋酸发酵。1 L 圆柱形玻璃罐中加入600 mL 安梨皮渣发酵酒液，接种0.5%醋酸菌发酵剂，玻璃罐用4 层纱布封口，30 ℃培养箱中静置培养。每24 h 取样检测，待样品总酸含量（以醋酸计）没有变化时结束发酵。

9）过滤处理

硅藻土过滤后得到的澄清醋液，一部分用于芳香成分检测，另一部分醋液进行陈酿。

10）陈酿处理

醋液置于密封玻璃瓶中，40 ℃陈酿1 个月。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 理化指标检测

可溶性固形物含量采用手持式折光仪测定；总酸生成量采用酸碱滴定法[12]测定；酒精度（乙醇含量）采用酒精计法[12]测定。

1.3.2.2 酶活性测定

取0.5 mL 的固定化酶，加入0.5 mL、5 mmol/L 的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-Dglucopyranoside，PNPG）于40 ℃反应10 min 后加2 mL、1 mol/L 的Na2CO3终止反应，10 000 r/min 离心15 min，于405 nm 处测上清液OD 值。酶活单位为每分钟催化底物水解产生1 μmol 的对硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）所需的酶量为一个酶活单位，单位以U 表示。

1.3.2.3 酶活回收率

酶活回收率是指磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶的酶活与制备固定化酶时所用游离酶的酶活之比。

1.3.2.4 挥发性成分检测

顶空固相微萃取条件：准确量取8 mL 安梨皮渣酒于装有磁力搅拌子的20 mL 顶空瓶中，加入2.4 g NaCl和8 μL 终浓度为145 μg/L 的内标物2-辛醇，于50 ℃磁力搅拌器上预热5 min 后，使用50/30 μmPDMS 型极性萃取头萃取吸附40 min，之后解吸3 min 用于GC-MS 分析。

GC-MS 条件：50 ℃保持3 min，以3 ℃/min 的速率升温至80 ℃，再以10 ℃/min 速率升温至250 ℃，保持10 min；载气为He，体积流量1.0 mL/min；色谱柱为HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25μm）；前进样口温度260 ℃；检测器温度280 ℃；离子源温度280℃；电离方式为电子电离；电子能量70eV；质量扫描范围为50～450 amu。

1.4 数据处理

GC-MS 挥发性物质定性、半定量分析：选择匹配因子大于或等于80%的组分，经质谱数据库NIST 11s.LIB 和Wiley 7.LIB 检索及资料分析，确认其香气成分，同时用内标法进行半定量（以终浓度145 μg/L 的2-辛醇为内标物，计算待测组分的含量[13]）。试验数据重复3 次，取平均值，并采用Excel 2010 软件处理。

2 结果与分析

2.1 安梨皮渣酒、醋挥发性物质的总离子流分析

安梨酶解皮渣酒与对照皮渣酒（不加β-葡萄糖苷酶）挥发性物质的总离子流图见图1。

图1 安梨对照皮渣酒与β-葡萄糖苷酶酶解皮渣酒总离子流图Fig.1 Total ion flow of control sample and wine sample with β-glucosidase

从图1 可以看出，对照与酶解安梨皮渣酒总挥发性物质中浓度较高组分分别出现在31、21、5、18 min左右。安梨酶解皮渣醋挥发性物质总离子流图见图2。

图2 安梨酶解皮渣醋挥发性物质总离子流图Fig.2 Total ion flow of vinegar sample with β-glucosidase

由图2 可知，挥发性总物质明显少于安梨皮渣酒，且总挥发性物质中浓度较高组分出现时间与皮渣酒明显不同。

2.2 安梨皮渣酒、皮渣醋挥发性物质组成及分析

磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶处理皮渣发酵酒、皮渣醋中的芳香成分经过定性和定量分析得到的结果见表1。

表1 安梨皮渣酒、皮渣醋挥发性物质组成Table 1 Composition of volatile substances in wine and vinegar samples

由表1 可知，在安梨皮渣酒和皮渣醋中检测出的挥发性物质包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、苯、烯烃及杂环类，其中醇类物质和酯类物质为安梨皮渣酒和皮渣醋中的主要挥发性成分，是安梨皮渣酒和醋的主要风味物质。

从GC-MS 检测出的挥发性物质数量上看，安梨酶解皮渣酒共检测出挥发性物质62 种，对照皮渣酒样品为57 种，酶解皮渣醋中挥发性物质最少，为41 种。

从挥发性物质总含量上看，酶解皮渣醋中挥发性物质总含量最高，达到10 179.19 μg/L。酶解皮渣酒挥发性物质总含量为6 706.43 μg/L，较对照（未加β-葡萄糖苷酶的皮渣酒）提高98.20%。

安梨酶解皮渣酒样品中醇类和酯类物质数量较对照差异不大，而总含量（6 506.84 μg/L）较对照样品（3 307.45 μg/L）提高了96.73%。酶解皮渣醋样品中醇类和酯类物质数量仅为皮渣酒中的一半，但是两者的总含量达到9 243.62 μg/L，较酶解皮渣酒提高42.06%，较对照皮渣酒提高179.48%。

其他类物质对贡献香气形成也占有一定比重，皮渣酒和皮渣醋中检测出的挥发性芳香成分还包括酚类、酮类、醛类、酸类、苯、烯烃类和杂环类物质，虽然其总含量不高，但由于某些物质香气阈值较低，使其在风味上均具有一定的贡献。

2.3 安梨皮渣酒、醋中挥发性酯类物质组成

磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶处理皮渣酒、皮渣醋中的挥发性酯类物质组成与含量见表2。

表2 安梨皮渣酒、醋中挥发性酯类物质组成与含量Table 2 Composition and content of volatile esters in wine and vinegar samples

酯类化合物是构成芳香成分的重要物质，具有独特的水果香气[14]。本试验中酯类物质在酶解皮渣酒、皮渣醋和对照样品中均占有较大的比重。酶解安梨皮渣酒中的酯类物质主要有辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、苯甲酸乙酯等，酶解皮渣醋中的酯类物质主要有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、2-苯基乙酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇乙酸酯、甲酸庚酯、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酸酯、辛酸乙酯等。其中，在多种梨中被检测出的梨特征性香气物质乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯均存在于安梨皮渣酒和皮渣醋样品中[15]。

经过糖苷酶酶解的安梨皮渣酒样品，与对照相比，其酯类物质含量上均有不同程度的提高。其中，乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸己酯含量分别较对照提高了74.38% 、131.32% 、91.06%、1 123.08%和104.57%。

酶解皮渣醋样品中存在12 种酯类物质，其中乙酸乙酯（2 445.98 μg/L）、3-甲基-1-丁醇乙酸酯（452.34 μg/L）、2-苯基乙酸乙酯（452.34 μg/L）和2-甲基-1-丁醇乙酸酯（117.27 μg/L）的含量较高。存在于安梨皮渣酒和皮渣醋中相同的酯类物质为8 种，安梨皮渣酒在经过醋酸发酵后酯类物质减少了19 种，新增4 种，其中乙酸乙酯在酶解皮渣醋样品中的含量远远高于安梨皮渣酒样品，分别为酶解皮渣酒和对照皮渣酒样品的13.9 倍和24.2 倍，乙酸乙酯为酶解皮渣醋主要风味的贡献者。

2.4 安梨皮渣酒、醋中挥发性醇类物质组成

表3为磁性凝胶固定化β-葡萄糖苷酶处理皮渣酒、皮渣醋中的挥发性醇类物质的组成与含量。

酵母菌生成的醇类化合物多数具有芳香、酸败等积极或不积极气味。其在酒中不仅可以丰满口感，还可增加酒的协调性。醇类物质在皮渣酒中所占比例也较高，对照皮渣酒和酶解处理皮渣酒分别检测出22 种和24 种。经过β-葡萄糖苷酶酶解后的各种醇类的含量均较对照有所增加（除[R-（R*，R*）]-2，3-丁二醇和[S-（R*，R*）]-2，3-丁二醇外），其中增长率超过100%的醇类物质达到了14 种，并且新生成了香茅醇和橙花叔醇两种萜烯醇化合物。在酶解皮渣酒样品中，3-甲基-1-丁醇含量最高，其具有白兰地香气和辛辣味，在多种梨酒中均有检出[16-17]。相比酶解皮渣酒，经过醋酸发酵后的皮渣醋液中损失醇类物质17 种，新生成醇类物质5 种，其中包括2-壬醇（234.55 μg/L）、乙酸-2-辛醇（167.53 μg/L）、1-庚醇（33.51 μg/L）、3-壬醇（16.75 μg/L）和2，3-丁二醇（11.52 μg/L）。其中，苯乙醇（有玫瑰香、紫罗兰香和茉莉香等多种风味[18]）在醋酸发酵后含量增长最多，为酶解皮渣酒样品的3.95 倍；3-甲基-1-丁醇则较皮渣酒中含量略有降低，这两种醇类在安梨皮渣醋样品中占醇类物质总含量的80.77%，为皮渣醋中主要醇类物质。

2.5 安梨皮渣酒、醋中其他挥发性物质的组成

安梨皮渣酒、皮渣醋中的其他挥发性物质组成与含量见表4。

由表4 可知，其他类物质对贡献香气形成也占有一定比重，除2-辛酮外，经过β-葡萄糖苷酶酶解的皮渣酒样品各物质含量均较对照有所提高，如增长率超过100%的有2-乙基-己酸（510.32%）、L-薄荷酮（403.23%）、1-（2，6，6-三甲基-1，3-环己二烯-1-基）-2-丁烯-1-酮（321.62%）和己酸（317.11%）等7 种物质，酶解后新生成的物质为1，1-二乙氧基-3-甲基-丁烷和松油烯。

酶解皮渣酒样品经醋酸发酵后生成的物质有6 种酸类物质（辛酸、3-甲基-丁酸、2-甲基-丁酸、2-甲基-丙酸、正癸酸、环己-1，4，5-3-酮-1-羧酸）、4 种酮类物质（3-羟基-2-丁酮、2-壬酮、3-壬酮、紫罗兰酮）、4 种苯系物[戊基苯、己基苯、1，3-二甲基丁基-苯和1-甲基-2-（1-乙基丙基）-苯]、2 种酚类物质[丁香酚、4-（2-丙烯基）-苯酚]和1 种醛类物质（苯甲醛），其物质组成上与皮渣酒样品差异较大。其中含量较高的辛酸（284.81 μg/L）、3-羟基-2-丁酮（134.03 μg/L）和苯甲醛（117.27 μg/L）均在苹果醋、梨醋中被检测出[19-20]。

3 讨论与结论

本文以安梨皮渣为原料，利用固定化β-葡萄糖苷酶酶解增香，以提高安梨皮渣酒的风味。此外，以固定化β-葡萄糖苷酶酶解皮渣酒样品为原料进行醋酸发酵，制备安梨皮渣醋。

经GC-MS 定性和半定量分析，对照皮渣酒、酶解皮渣酒和皮渣醋样品中分别检测出芳香成分57 种、62种和41 种，检测出的芳香成分均包括酯类、醇类、酸类、酮类、醛类、酚类、烯烃类、杂环类物质以及苯系物。其中，醇类和酯类物质在3 种样品中均占有重要地位，对安梨皮渣酒和皮渣醋的风味构成具有很大贡献。

固定化β-葡萄糖苷酶酶解处理皮渣酒样品中挥发性物质总含量（6 706.43 μg/L）较对照皮渣酒（3 383.61 μg/L）提高了98.20%，其中，酯类和醇类物质提高幅度较大，分别较对照提高100.84%和95.04%。具有梨果实特征性的香气物质乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、芳樟醇、4-萜烯醇、辛醇等物质含量有较大幅度提高。另外，固定化β-葡萄糖苷酶酶解处理皮渣发酵酒中增加的物质有香茅醇（3.12 μg/L）、橙花叔醇（1.56 μg/L）和松油烯（1.56 μg/L），这些物质具有独特而浓郁的果香，表明固定化β-葡萄糖苷酶能有效酶解糖苷键，释放配糖基，从而产生浓郁、特征性的芳香气味，提高安梨发酵酒的香气品质。

从发酵后挥发性物质总含量上看，安梨皮渣醋中挥发性物质总含量为1 0179.19 μg/L，较皮渣酒有较高的提升。安梨皮渣醋样品中醇类和酯类物质数量总含量达到9 243.62 μg/L，占总挥发性物质含量的90.8%。安梨皮渣醋样品中存在12 种酯类物质，其中乙酸乙酯（2 445.98 μg/L）、3-甲基-1-丁醇乙酸酯（452.34 μg/L）、2-苯基乙酸乙酯（452.34 μg/L）和2-甲基-1-丁醇乙酸酯（117.27 μg/L）的含量较高。存在于安梨皮渣酒和皮渣醋中相同的酯类物质为8 种，安梨皮渣酒在经过醋酸发酵后酯类物质减少了19 种，新增4 种，其中乙酸乙酯在皮渣醋样品中的含量远远高于安梨皮渣酒样品，分别为酶解皮渣酒和对照皮渣酒样品的13.9 倍和24.2 倍，表明乙酸乙酯为安梨皮渣醋主要风味的贡献者。

综上所述，固定化β-葡萄糖苷酶酶解处理可有效提高安梨皮渣酒的挥发性香气物质，尤其是果实特征性香气物质含量，表明固定化β-葡萄糖苷酶的酶解在提高安梨皮渣酒的特征性香气物质方面具有重要作用。β-葡萄糖苷酶酶解后的安梨皮渣酒经过醋酸发酵后挥发性物质总含量有明显提高，此外，安梨皮渣酒和皮渣醋的香气成分组成上差异较大，表明酶解皮渣醋在提高安梨本身特征性香气的同时，进一步形成了具有水果醋的特征性香气物质。