菠菜根尖细胞有丝分裂同步化诱导

曹莹

摘 要：本研究以菠菜（Spinacia oleracea L.）根尖分生组织为材料，采用羟基脲（HU）和甲基胺草磷（APM）结合的双阻断法对菠菜根尖细胞进行处理，结合显微镜观察和统计学分析结果，对有丝分裂中期同步化诱导作了探讨，并对中期染色体分离也作了初步研究。在试验中分别设置了羟基脲（HU）和甲基胺草磷（APM）的不同浓度梯度，并对甲基胺草磷（APM）设置了作用时间梯度，以研究其最佳同步化诱导效果。结果表明，经1.25 mmol/L HU、10 μmol/L APM处理菠菜根尖细胞，能够使细胞有丝分裂中期指数（Met．I）达40％。

关键词：同步化；中期指数；羟基脲；甲基胺草磷；菠菜

文章编号：1005-2690（2023）18-0001-03       中国图书分类号：S636.1       文献标志码：B

植物细胞的同步化诱导是指细胞分裂周期受到低温或药物处理的干扰，使大多数细胞停留在同一分裂阶段（通常是中期）[1]。人工诱导同步化主要有2种方法。一是DNA合成阻断法。采用一定量的低毒或无毒的特异性DNA合成抑制剂（通常是TdR或羟基脲）加入培养液，培养一定时间（TG2+TM+TG1）后，使细胞停留于S期，且不影响处于其他时相的细胞进行周期的运转。抑制剂去除后，细胞就可进行同步化运转[2]。二是分裂中期阻断法。细胞分裂中期，大量微管参与形成细胞分裂器——纺锤体，从而保证细胞分裂过程的完成。此时以药物抑制微管形成纺锤体，则可以将运转中的细胞阻断于分裂中期。

高等植物细胞有丝分裂同步化诱导获得的细胞群体中，获得大量分裂时期一致的细胞，便于后续对细胞周期调控、染色体形态分析、染色体显微解剖和性别决定机制的研究。由于植物细胞壁结构的性质，早期以悬浮细胞系为材料，诱导植物细胞有丝分裂过程中的中期染色体分离同步化的研究进展十分缓慢。目前，对春小麦、凤仙、大麦和蚕豆根尖分生组织细胞同步化诱导的研究已被证明是有效的[3-6]，利用玉米细胞系的有丝分裂同步诱导和染色体分离方法也显示有效[7]。

本研究中所采用的植物材料——菠菜，又名波斯菜、赤根菜等，为藜科菠菜属1年生或2年生草本植物，四季均可播种，以春播和秋播为主，生长期约为60 d。菠菜原产于波斯（现伊朗），唐代传入我国，栽培历史悠久。菠菜主根发达，肉质根红色，味甜可食。菠菜是研究雌雄异株的模式植物之一，研究主要集中于细胞学、生理生化和分子标记上。菠菜处于性染色体演化的第2阶段，具有绝对雄株、营养雄株、绝对雌株、雌雄同株、雄全同株、雌全同株和三性同株等多种不同的性别表现类型[8-9]。本研究所进行的同步化诱导研究，可以从形态学上将不同性别表现类型的菠菜进行染色体对比，为后续菠菜性别分化的相关研究奠定基础。

本试验以菠菜根尖为材料，采用羟基脲和甲基胺草磷双阻断法处理菠菜根尖，对菠菜根尖分生组织进行有丝分裂中期高频同步化诱导实验，以准确识别菠菜体细胞中染色体的形态、数量和分布，为后续染色体分析、性别决定分析和性别决定基因研究提供技术基础。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 植物材料

菠菜种子购自种子公司。

1.1.2 试验试剂

羟基脲溶液：用蒸馏水稀释到不同浓度，分别是1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L。

甲基胺草磷溶液：用蒸馏水稀释到不同浓度，分别是2.5、5.0、10.0 μmol/L。

卡诺氏固定液：无水乙醇和冰乙酸以3∶1比例配制。

1 mol/L HCl：37％浓盐酸82.5 mL（比例是1.19 g/mL）用蒸馏水定容至1 000 mL。

酸解液：HCl 1mol/L与45％乙酸以3∶1比例配制。

羟基脲：粉末于18～25 ℃条件下保存，遇热易分解，使用时配母液于4 ℃保存，保存时间不宜超过15 d。

甲基胺草磷：试剂有一定毒性，且溶解性较小，配制试剂时应注意，可用磁力搅拌器促进其溶解。

1.1.3 试验器材

主要仪器：光学显微镜、磁力搅拌器、LRH-70生化培养箱、显微镜、水浴锅、低温冰箱、量筒、烧杯等。

1.2 试验过程

1.2.1 细胞有丝分裂中期同步化诱导

浸種：取菠菜种子100～200粒于培养箱23～25 ℃恒温浸泡菠菜种子24 h，吸水后放于4 ℃冰箱变温处理24 h。

萌发：在干净的培养皿中铺上2～3层浸透了双蒸水的滤纸，将处理过的种子均匀分布在培养皿中，然后放入24 ℃的恒温箱中。

双阻断法药物处理：准备经1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L HU浸泡双层滤纸培养皿，选取根尖长度约1.5 cm的种子，转移到培养皿中孵育18 h，用双蒸水冲洗3～4次，再转移到双蒸水浸泡滤纸培养皿中孵育约3 h，转移至铺有双层分别用0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L APM浸湿滤纸的培养皿中培养3～6 h，蒸馏水冲洗3次，同步化处理根尖进行过夜固定，4 ℃储存备用[10-11]。

在试验中每次改变试剂培养前先用该试剂浸泡种子1 min，培养过程均在黑暗条件下进行。

1.2.2 中期分裂相观察与统计

将固定根尖置于酸解液中（60±1）℃下酸解15～20 min，压制细胞后，用改良品红染色，用光学显微镜观察，并测定其有丝分裂指数（Met．I）。制片时，切取每条去除根冠的根1 mm左右，即分生组织所在区域，进行制片（常制1～2张片子，大多数为1张片子），用光学显微镜进行观察（详见图1）。观察并统计细胞（整片）数时，移动载玻片和镜头，同时拍照计数。

2 试验结果

本研究用HU和APM双阻断法来诱导菠菜根尖细胞的有丝分裂中期同步化。在试验过程中，通过调整HU、APM的处理浓度、水培和时间等同步化条件，获得了较高频率的同步化细胞。

结果表明，当在23 ℃下用1.25 mmol/L HU处理18 h，室温下10 μmol/L APM处理4 h，可得到较为理想的结果，其有丝分裂中期指数（Met．I）可达40％（如图2所示）。

用HU处理分裂期细胞，可有效阻断DNA合成过程，在除去HU作用后，又可以迅速恢复DNA合成过程，以达到初步同步化的目的[12-13]。同时，由于APM是一种直接与细胞内微管蛋白合成相互作用的特异性药物，可以成功阻断中期细胞纺锤丝的发育，使有絲分裂过程保持在中期[14]。本研究在利用HU和APM对菠菜根尖分生组织细胞进行双阻断后，除少数处于分裂间期的细胞外，没有发现处于分裂前期、后期或末期的细胞，表明细胞的分裂过程已被成功阻断在分裂中期，有丝分裂正常，染色体无畸变（如图3和图4）。由此可知，利用HU-APM双阻断法可有效将菠菜根尖分生组织细胞阻断在中期[15-16]。

3 讨论和结论

动物能够相对容易地成功分离和纯化中期染色体，而在植物中，由于细胞壁结构坚韧，细胞很难去体积和溶解，去体积后留下大量细胞碎片，使染色体的进一步纯化更加困难，因此进展缓慢。HU和秋水仙碱以前被用于诱导植物细胞有丝分裂同步，但一些研究表明，用于诱导有丝分裂同步的秋水仙碱浓度过高，导致显著的染色体凝集，从而使染色体的形态结构研究变得困难，而且Met．I的比值也偏低。因此，诸多研究者采用APM来替代秋水仙碱。

分裂中期阻断法的优点在于操作简便、效率高，缺点是药物毒性较大，如果处理时间过长，获得的细胞常常不能恢复成正常细胞进行周期运转。在同步化诱导的过程中，较有效的做法是几种方法并用（如低温、TdR、nocodazole等综合处理），可获得数量多、同步化效率高的细胞群。

本研究采用的分离中期染色体的方法是采用1.25 mmol/L HU和10 μmol/L APM的双阻断诱导菠菜根尖细胞有丝分裂中期同步化的方法，将菠菜根尖有丝分裂中期细胞去壁，并进一步裂解细胞使其释放染色体。在光镜下，观察到用HU-APM双阻断法同步化的菠菜根尖的染色体样品中，可看到大量中期细胞，且细胞碎片较少，同步化效果较好，且获得的中期细胞染色体形态清晰完整，便于今后对不同性别类型的菠菜染色体进行形态学分析，进而对菠菜的Y染色体进行特异性锁定分析、染色体显微切割技术研讨、单条染色体基因文库的构建等，同时，也为后续对菠菜性别决定分子遗传学的研究提供了研究基础。

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（编辑：郭志阳）