柱前衍生-高效液相色谱法测定构树饲料中氨基酸的含量

赖红芳，潘立卫，韦雪梅，覃国乐，黄秀香

（河池学院化学与生物工程学院，广西宜州 546300）

构树（Broussonetia papyrifera）是一种桑科落叶乔木，雌雄异株，又叫楮树，含有丰富的蛋白质和多种微量元素，是一种优质的畜禽饲料资源（龚利福等，2021 ；彭皓等，2019）。由于构树叶中的蛋白质分子结构复杂，直接让畜禽食用新鲜的构树叶，蛋白质不易被畜禽吸收（陶兴无，2005），因此，对构树叶进行发酵处理可以有效提高猪、鸡等畜禽对构树饲料中蛋白质的利用率和动物机体的免疫机能和抗病能力，且对肉蛋白质有所改善（夏敏等，2020 ；蔡玉等，2019 ；邳植等，2018）。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，因此，测定氨基酸的含量及构成可以了解蛋白质生物效价，也是评价动物饲料质量的重要指标。检测氨基酸的方法有分光光度计法（中华人民共和国农业部，2019）、液相色谱- 质谱串联法（郭尚伟等，2016）、气相色谱法（Roessner 等，2000），氨基酸自动分析法（张苏平等，2017）和高效液相色谱法（刘成模等，2022）。分光光度计法操作简单，但检测种类单一，且无法对氨基酸进行分离；氨基酸自动分析仪价格昂贵，检测成本高，不适合广泛运用（张椿翊等，2022）；高效液相色谱法检测氨基酸操作简单、样品用量少、选择性好、分离效率高（魏姜勉，2021），且采用柱前衍生具有灵敏度高，重现性好等优点（欧阳道福，2018），因此，本研究采用酸水解法来提取发酵构树饲料中的氨基酸，并对水解条件进行优化，建立一种邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生- 高效液相色谱检测构树饲料中的氨基酸方法，为构树饲料中氨基酸含量的分析检测提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 饲料：杂交构树饲料、野生构树饲料（发酵的时间为2021 年10 月29 日），由河池学院化学与生物工程学院覃国乐教授提供。

18 种氨基酸标准品：Solarbio，乙腈、甲醇（色谱纯），盐酸、氢氧化钠磷酸氢二钠、无水乙酸钠、邻苯二甲醛（OPA）、硼酸、苯酚、冰乙酸均为分析纯。

1.1.2 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent 8453 紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；FE 28 酸度计（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的水解 将构树饲料烘干、粉碎、过筛，除去油脂和色素，烘干、备用。按文献（木合布力阿布力孜等，2011）对样品进行水解后离心，吸取上清液1.0 mL 水浴蒸干，残渣用2.0 mL 0.1 mol/L 的HCl 溶液溶解，过无机膜（0.45 μm）后保存，备用。

1.2.2 氨基酸的衍生方法 移取75 μL 的氨基酸水解液，依次加入300 μL（pH = 9.0）的缓冲盐溶液、150 μL 的OPA 衍生剂溶液、75 μL 10%的冰乙酸溶液（调节pH值至中性）、900 μL纯水，定容到1.5 mL，衍生5 min 后排气泡，过有机膜（0.45 μm），待上机。

1.2.3 标准曲线的绘制 准确称取天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸标准品各0.05 g 于小烧杯中，用0.1 mol/L 的HCl 溶液溶解并定容至50 mL 容量瓶中，摇匀，得到浓度为1.0 g/L 的氨基酸混合标准溶液。按文献（淳泽利等，2019）操作，按1.2.2 的方法进行衍生，取1μL 衍生液在1.2.4 条件下测试。以峰面积为Y轴，氨基酸的质量浓度为X轴，得出各氨基酸标准曲线方程和相关系数。

1.2.4 色谱分析条件 色谱柱：Advance Bio AAA 反相色谱柱（4.6×100 mm，2.7μL）；流动相A 为10 mmol Na2HPO4，pH=8.2（±0.2）；流动相B 为乙腈-甲醇-纯水（体积比为45：45：10）；流速0.8 mL/min，柱温40℃，进样量：1μL，检测波长为338 nm；流动相洗脱梯度如表1 所示。

表1 洗脱梯度程序

1.2.5 饲料中氨基酸水解条件的优化 采取单因素试验，以氨基酸峰面积的大小为主要参考对象，对氮气（通入、不通入）、水解温度（80、90、100、110、120 ℃）、水解时间（10、15、20、24、26 h）、水解液浓度（4、5、6、7、8 mol/L 的HCl 溶液）4 个因素进行试验，研究不同条件对饲料中氨基酸水解的影响，筛选出符合饲料中氨基酸水解的最佳条件。

2 结果

2.1 饲料中氨基酸水解条件的优化

2.1.1 氮气对饲料中氨基酸水解的影响 由图1可知，通入氮气水解的效果比没有通入氮气水解好，因为氮气是惰性气体，水解时可以避免氨基酸在高温时被氧化，起到保护作用。

图1 通入氮气对饲料中氨基酸吸收峰面积的影响

2.1.2 HCl 浓度对饲料中氨基酸水解的影响 由图2 可知，随着HCl 溶液浓度的增大，氨基酸的峰面积也随之增加；当HCl 溶液浓度为6 mol/L，氨基酸的峰面积达到最大值，但当浓度继续增大，氨基酸的峰面积均呈下降趋势。因为HCl 浓度过低时，达不到蛋白质水解的酸度要求，过高时，部分氨基酸会被破坏。

图2 HCl 浓度对饲料中氨基酸的吸收峰面积的影响

2.1.3 水解温度对饲料中氨基酸水解的影响 由图3 可知，随着水解温度升高，各氨基酸的峰面积也逐渐升高，在110℃达到最大值，但温度继续升温，氨基酸的峰面积呈下降趋势。温度过低时水解速率慢；温度过高时氨基酸会发生脱氨和脱羧等反应。

图3 水解温度对饲料氨基酸的吸收峰面积的影响

2.1.4 水解时间对饲料中氨基酸水解的影响 如图4 所示，随着水解时间的增加，氨基酸的峰面积呈上升趋势，但水解了24 h 后氨基酸的峰面积开始降低，说明24 h 水解基本完成，再增加时间反而使氨基酸分解或被氧化。

图4 水解时间对氨基酸峰面积的影响

结合单因素试验结果可知，水解的最优条件为：通入氮气作保护气，6 mol/L 的HCl 溶液作为水解液，水解时间为24 h，水解温度为110℃。

2.2 系统适用性 取衍生化后的标准品液和样品液1μL，按照“1.2.4”中的仪器方法进行测定。结果表明，衍生化后的18 种混合氨基酸标准品和样品的色谱峰中除了甘氨酸和苏氨酸不能分开外，其余的16 氨基酸峰形尖锐，分离度良好，如下图所示。可用于饲料中氨基酸含量的测定。

图5-1 18 种氨基酸标准品色谱图

图5-2 野生构树饲料所含氨基酸的色谱图

图5-3 杂交构树饲料所含氨基酸的色谱图

2.3 线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限由表2 可知，按1.2.3 操作后，以氨基酸标准品质量浓度（X）为横坐标，相应的峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程及氨基酸的检出限。结果表明，16 种氨基酸的相关系数为0.9991 ～0.9999。

表2 试验方法的线性范围和检出限

2.3 精密度试验 移取氨基酸混合标准溶液75μL，按1.2.2 衍生方法进行衍生，按1.2.4 方法平行测定5 次，以这5 次测出来的峰面积来考察仪器的精密度，5 次测定结果的RSD 值为0.74% ～3.57%（n=5）。

2.4 重现性实验 准确称取3 份杂交构树饲料样品，按照1.2.1 和1.2.2 的方法进行操作，再按1.2.4 方法测定，记录16 种氨基酸的峰面积，结果显示，16 种氨基酸峰面积对应的相对标准偏差RSD 为0.44% ～3.76%。

2.5 构树饲料中氨基酸的含量测定与结果分析构树饲料按1.2.1 和1.2. 2 进行操作后（n=3），按1.2.4 方法测定，结果如表3 所示。由表3 可知，杂交构树饲料检测出15 种氨基酸，含量最高的是谷氨酸。必需氨基酸有5 种，占总氨基酸的36.22%，含量从多到少的排序为亮氨酸＞苯丙氨酸＞缬氨酸＞赖氨酸＞异亮氨酸。野生构树饲料检测出14 种氨基酸，含量最高的是谷氨酸。必需氨基酸有5 种，占总氨基酸的34.74%，含量从多到少的排序为亮氨酸＞缬氨酸＞赖氨酸＞苯丙氨酸＞异亮氨酸。

表3 样品中氨基酸含量的测定结果

2.6 加标回收率实验 准确称取杂交构树饲料样品3 份，加入同一水平的氨基酸混合标准液1 mL，按照1.2.1 和1.2.2 方法操作，再按1.2.4 方法测定，考察方法的回收率。得到平均回收率为90.5% ～107.8%。

3 讨论

邻苯二甲醛（OPA）作为衍生剂，氨基酸的衍生时间短，只需5 min，缩短了氨基酸的分析检测时间（齐麟等，2022），而且氨基酸的分离效果较好，峰型好看、不拖尾，准确度和精密度较好，能满足构树饲料的氨基酸含量测定需要。

由表3 可知，杂交构树饲料的总氨基酸比野生构树饲料的高，这可能是杂交构树通过杂交育种后，在人工种植过程比野生构树生长的环境好（曹力凡等，2021 ；郭琪等，2020）。杂交构树饲料的总氨基酸为8.53 g/100 g ；野生构树饲料的总氨基酸含量为7.11 g/100 g ；与玉米饲料的总氨基酸（8.1 g/100 g）相差不大（尤晓蒙，2015），可以考虑用构树饲料取代玉米，减少成本，缓解蛋白质饲料不足的问题（陈景来，2022）。为养殖户在选择饲料上提供一定的参考价值，也为构树饲料的开发利用提供了理论依据。

4 结论

采用柱前衍生- 高效液相色谱法对构树饲料中的氨基酸进行测定，结果显示，构树饲料中16种氨基酸的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，回收率为90.5% ～107.8%。构树饲料的氨基酸种类丰富，总氨基酸含量高，因此，氨基酸可作为评价构树饲料品质的重要指标之一。