溶瘤病毒和自然杀伤细胞来源外泌体杀伤肿瘤作用的研究进展

李 雪，王 华

（1.安徽医科大学生命科学学院，安徽 合肥 230032；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850）

传统的肿瘤治疗方法包括化疗、放疗和手术治疗等，单独治疗后易发生肿瘤复发和转移［1］，因此联合治疗是肿瘤治疗的发展趋势。目前多种治疗手段联合应用在肿瘤治疗中取得较好效果，如放疗联合抗血管生成治疗、放疗联合免疫治疗、双免疫联合疗法和靶向治疗联合抗血管生成治疗等［2］。现代免疫疗法中，溶瘤病毒（oncolytic viruses，OV）成为使用免疫检查点抑制剂治疗后无反应或不能实现持久反应肿瘤患者的潜在治疗选择。OV 通过选择性感染肿瘤细胞，在靶细胞中大量复制并最终使其裂解，同时还能引发先天性和适应性免疫应答，调节实体瘤免疫抑制微环境，从免疫抑制转变为免疫激活［3］。基于复杂的肿瘤微环境，将OV 与不同抗肿瘤药物合理组合，可能会进一步提高肿瘤治疗的效果。自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）来源的外泌体（NK-derived exosomes，NK-Exo）具有纳米级大小、较强的组织穿透性和较低的免疫原性等特点，成为基于细胞疗法的肿瘤治疗研究热点。NK-Exo 内含有许多细胞毒性蛋白，可引起肿瘤细胞凋亡。此外，其还可携带抗肿瘤药物，借助其肿瘤靶向能力，将抗肿瘤药物精准带至肿瘤组织。除细胞毒性作用和传递药物外，NK-Exo 还可刺激免疫细胞，减弱肿瘤细胞的免疫抑制效应，通过旁分泌途径或循环系统靶向免疫系统发挥免疫调节作用［4］。NK-Exo凭借其抗肿瘤特性、介导免疫细胞活化的能力和下调免疫检查点表达的能力，与OV 的抗肿瘤作用可能相辅相成。本文主要综述OV 和NK-Exo 治疗肿瘤的作用及其机制研究进展，以期为发现新的抗肿瘤策略提供思路。

1 溶瘤病毒治疗肿瘤的作用

OV 是一类能选择性感染和杀伤肿瘤细胞的病毒，具有特异性复制能力，能激发机体产生抗肿瘤免疫反应，同时不会对正常细胞造成伤害。作为一种新型免疫疗法，OV 在近几十年逐渐发展为基因疗法的一大热点，该治疗策略也逐渐得到广泛关注［5］。按遗传物质的不同可将OV 分为2 类：DNA病毒和RNA 病毒。DNA 病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和腺病毒，RNA 病毒有呼吸道肠道病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、水泡性口炎病毒和新城疫病毒。

近年来，随生物技术的发展，OV 作为一种有效的肿瘤治疗手段取得里程碑的进展。截至目前共上市4 款OV 类药物：ECHO-7 病毒（Rigvir）、重组人5 型腺病毒注射液（安柯瑞，oncorine）、单纯疱疹病毒（Lmlygic，又称为T-VEC）和第3 代溶瘤单纯疱疹病毒1 型Teserpaturev（Delytact，G47Δ），其中ECHO-7（Rigvir）病毒主要适用于黑色素瘤，重组人5 型腺病毒注射液（安柯瑞）主要适用于头颈癌、肝癌、胰腺癌和宫颈癌等，单纯疱疹病毒（Lmlygic）主要适用于晚期转移性黑色素瘤，Teserpaturev（Delytact，G47Δ）主要适用于恶性神经胶质瘤或任何原发性脑癌［6］。目前已有多种病毒作为OV 载体开展了临床试验［7］。截至2023 年3 月，在ClinicalTrials.gov 网站注册的溶瘤病毒治疗肿瘤的临床研究158 余项，其中单纯疱疹病毒（Lmlygic）已开展针对黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌和胃癌患者的临床试验［8］；腺病毒（DNX-2401）已开展针对胶质母细胞瘤患者的临床试验［9］；牛痘病毒（Pexa-Vec）已针对索拉非尼耐药性肝细胞癌开展临床试验［10］；新城疫病毒（NDV MTH-68/H）已针对结直肠癌、霍奇金病、多形性胶质母细胞瘤和黑色素瘤开展临床试验［11］；呼肠孤病毒（Reolysin）针对乳腺癌、头颈癌和黑色素瘤开展临床试验［12］。

1.1 溶瘤病毒抗肿瘤作用机制

OV通过2种不同的作用机制介导抗肿瘤活性，一是在肿瘤细胞内选择性复制导致对肿瘤细胞的直接溶解作用，二是诱导全身抗肿瘤免疫。OV 进入肿瘤部位，首先通过直接溶瘤作用引起肿瘤细胞免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD），释放多种肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA），TAA 与树突状细胞（dendritic cells，DC）识别结合后，通过淋巴反流进入淋巴结，将肿瘤抗原信息呈递给淋巴结中的幼稚T 细胞，诱导其分化产生肿瘤特异性效应T 细胞，激活肿瘤免疫反应。随着持续溶瘤和T 细胞特异性免疫攻击，释放出更多TAA，并通过DC 呈递产生更多效应T 细胞，引起一系列特异性肿瘤免疫应答。此外，分布在肿瘤淋巴结或局部炎症部位的记忆T细胞可对远处肿瘤进行免疫追踪，分化成效应T细胞杀死肿瘤细胞，减少恶性肿瘤细胞转移和复发［13］。其中，ICD 在获得性抗肿瘤免疫方面发挥至关重要的作用［14］。当肿瘤细胞中OV 复制诱导产生ICD 时，可释放TAA、损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns）以及OV 衍生的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns），同时表达上调多种炎症细胞因子，进而激活免疫反应［15］。

1.2 溶瘤病毒递送

OV 的有效性依赖于足够数量的病毒感染目标肿瘤细胞，使其裂解并将OV 扩散到邻近肿瘤细胞。因此，OV 最大的挑战就是有效递送，进而提高其对肿瘤细胞的感染效率，使OV 感染更多的肿瘤细胞，达到更好的治疗效果，从而延长患者存活期。

目前OV 的主要递送途径是瘤内注射，有利于病毒直接进入肿瘤，避免抗载体免疫力的攻击及滞留在某些脱靶位置，降低在非目标细胞中复制的风险，可精确控制肿瘤微环境中OV浓度，肿瘤区域浓度最大化，减少病毒清除，从而获得更好的治疗效果。

除瘤内注射外，静脉给药也是一种常见的给药途径。为克服中和抗体的中和作用和网状内皮系统的清除作用，有研究利用生物相容性聚合物如聚乙二醇和聚甲基丙烯酸羟丙酯对病毒外壳蛋白进行化学修饰，使病毒免受抗体中和作用，同时延长病毒血液循环时间；或通过使用环磷酰胺预处理消耗体液中的补体和免疫球蛋白等，抑制或延迟机体抗病毒反应，避免病毒被快速清除［16］。

近年来，基于细胞的递送载体成为最具潜力的OV 递送载体之一。利用细胞载体携带OV，可克服给药后的抗体中和、补体失活，规避宿主免疫系统对OV 的识别。常用的细胞载体有转化细胞（骨髓瘤细胞和白血病细胞等实体瘤细胞）、免疫细胞（T 细胞、单核巨噬细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞和髓源性抑制细胞）及祖细胞（间充质干细胞、神经干细胞和血管祖细胞）［17］。目前，已有多种细胞递送载体被成功应用于OV 递送。研究表明，骨髓瘤细胞可将麻疹病毒递送到骨髓中的转移性肿瘤［18］。面对机体存在的中和抗体时，DC 搭载呼肠孤病毒可携带并运送病毒至目的肿瘤［19］；抗原特异性T 细胞可以搭载水疱性口炎病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和逆转录病毒［20-23］，通过多种机制将其递送到肿瘤细胞。此外，间充质干细胞和神经干细胞具有肿瘤归巢特性，也是常用的OV 递送细胞载体［24-25］。

1.3 溶瘤病毒肿瘤趋向性和瘤内扩散增强策略

与正常血管相比，肿瘤血管系统结构紊乱，肿瘤内皮细胞上过表达的抗原有血管内皮生长因子受体2、血管细胞黏附因子和内皮细胞-白细胞黏附分子1 等。尽管OV 具有基于肿瘤细胞上一些过度表达的受体和黏附分子的肿瘤趋向性，但这种趋向性尚有待增强。有研究表明，携带血管内皮生长因子的辛德毕斯病毒（Sindbis virus）和一定剂量紫杉醇联合治疗可通过增加肿瘤血管内皮通透性和载体递送，促进病毒在肿瘤内的递送、感染和增殖，进而发挥协同作用，治疗肿瘤［26］。

此外，还有研究表明，通过基因编辑技术把牛痘病毒的B18R基因掺入溶瘤单纯疱疹病毒，可克服肿瘤内残留的抗病毒反应，提高抗肿瘤活性，实现协同效应［27］；还可使用小分子化学增敏剂中和肿瘤内残留的抗病毒活性，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂可抑制肿瘤细胞中残留的干扰素反应［28］，从而获得更好的抗肿瘤效果。常见的小分子化学增敏剂还有西罗莫司等，可通过抑制肿瘤抗病毒反应，减缓抗溶瘤病毒中和抗体产生，增强溶瘤病毒的瘤内传播［29］。

1.4 溶瘤病毒与其他疗法联合应用

由于物理屏障、肿瘤异质性和免疫抑制微环境的存在，目前OV 疗法的有效性尚待提高［30］。为克服OV单药治疗的局限性，研究人员尝试以OV为基础的联合治疗，包括与放疗、化疗、免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞治疗等联合，协同增强抗肿瘤疗效［31］。

1.4.1 OV与化疗和放疗等传统抗肿瘤治疗相结合

溶瘤性牛痘病毒静脉给药，联合放化疗治疗晚期头颈癌患者的Ⅰ期临床试验显示，溶瘤性牛痘病毒的有效性和安全性可通过放化疗得到提高［32］。研究表明，在化疗（吉他西滨、伊立替康或氟尿嘧啶）过程中加入Pelareorep（一种静脉注射溶瘤呼肠孤病毒）和帕博利珠单抗（pembrolizumab），治疗胰腺导管腺癌安全有效［33］。

1.4.2 OV与免疫检查点抑制剂相结合

已有多项临床试验开展了OV 与针对多个免疫检查点的抗体的联合抗肿瘤作用研究，其中程序性死亡受体1（programmed death receptor-1，PD-1）/细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）联合疗法表现出较好的治疗效果［34］。有研究评估了表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的溶瘤病毒单纯疱疹病毒（Lmlygic）与抗CTLA-4抗体伊匹木单抗（ipilimumab）联合使用，在晚期黑色素瘤患者中的有效性和安全性。结果表明，与单独使用伊匹木单抗相比，联合单纯疱疹病毒（Lmlygic）可显著增强全身抗肿瘤反应和具有更高的安全性，可能在晚期黑色素瘤治疗中具有重要的临床应用价值［35］。携带肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和重组人白细胞介素2（recombinant human interleukin-2，IL-2）的溶瘤腺病毒联合PD-1 阻断抗体可导致小鼠黑色素瘤完全消退［36］。

1.4.3 OV与CAR-T细胞疗法相结合

建立人胰腺导管腺癌异种移植免疫缺陷小鼠模型，用携带TNF-α 和IL-2 的溶瘤腺病毒（Ad-mTNFα-mIL2）与表达间皮素的CAR-T 细胞（meso-CAR-T）进行联合治疗。结果发现，Ad-mTNFαmIL2 增加CAR-T 细胞和宿主T 细胞对免疫抑制性胰腺导管腺癌肿瘤浸润，促进巨噬细胞M1 极化和DC成熟，可改变肿瘤微环境中免疫抑制状态［37］。

综上所述，OV 通过在肿瘤细胞中选择性复制，杀死肿瘤细胞，激活宿主的抗肿瘤免疫反应，并在肿瘤微环境中募集更多的效应淋巴细胞，通过多种途径触发肿瘤内的多机制细胞死亡途径达到杀伤肿瘤细胞的效果［38］。OV 的溶瘤能力取决于病毒的类型、治疗剂量以及病毒嗜性等，因此需要为每种肿瘤研发出适合的OV，通过最佳递送系统和最佳联合疗法获得更好的疗效和更高的安全性。由于OV 是一种条件复制型病毒，在杀死肿瘤细胞的同时还会发生复制，可能导致不同模型或个体有效剂量的不同，因此在相关非临床模型和临床试验中进一步建立安全有效的给药指南非常重要。肿瘤细胞的异质性，复发、转移和早期诊断失败，导致OV作为单一的抗肿瘤药物可能无法成功治愈肿瘤。因此，需要合理的联合治疗策略，克服OV 和其他疗法的固有局限性，如OV 因其可上调肿瘤局部免疫检查点表达，因此可与NK-Exo 相结合，进一步增强抗肿瘤效果。

2 NK来源外泌体治疗肿瘤的作用

外泌体是几乎所有类型的细胞都可以产生并释放的纳米囊泡，其内包裹蛋白质、脂质和核酸在内的多种生物活性物质。在生理环境中，通过配体-受体相互作用和质膜融合等不同机制与近距离或远距离的靶细胞相互作用，从而将其携带的内容物转移到靶细胞［39］，通过调节相关基因表达、蛋白质翻译、转录后调控和其他信号通路，对靶细胞进行调节。通常外泌体可表达其来源细胞的特定蛋白质，从而发挥与其来源细胞相似的特定功能。随着研究的不断深入，发现外泌体在机体免疫应答、抗原递呈、细胞迁移和肿瘤侵袭等方面均发挥重要作用［40］。同时，肿瘤微环境中低氧和酸性环境对外泌体影响较小，使其更容易在肿瘤组织内扩散，这些特征使得外泌体成为肿瘤生物学领域的研究热点。

NK 细胞是一类在先天性免疫和适应性免疫中发挥重要作用的细胞毒性淋巴细胞，在抗击肿瘤和病原体的免疫防御中发挥重要作用，通过与DC、T细胞和B 细胞交流，调节先天免疫和适应性免疫反应，并通过释放细胞毒性分子或连接活化受体诱导细胞凋亡，是宿主天然免疫的重要组成部分，是抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线。同时，NK 细胞可在无抗原致敏、无抗体参与且无主要组织相容性复合物限制的情况下非特异性直接杀伤肿瘤细胞，发挥强大的抗肿瘤作用［41］。

NK-Exo 含有典型的NK 分子，如CD56、NK2家族成员D、FasL、穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素及多种细胞毒性蛋白、微RNA（microRNA，miRNA）和细胞因子，同时NK-Exo 可在体外诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤具有杀伤作用［42］。越来越多的研究表明，NK-Exo 与NK 细胞具有相似的抗肿瘤活性，除抗肿瘤作用外，NK-Exo 还具有免疫调节功能［43-49］，因此在肿瘤治疗中发挥重要作用。

2.1 携带细胞毒性蛋白的抗肿瘤作用

有研究表明，NK-Exo 的细胞毒性作用不是依靠单一的蛋白质，穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B以及颗粒溶素均可在杀伤肿瘤的过程中发挥作用。NK-Exo释放的穿孔素，可在外泌体与靶细胞质膜融合时发挥打孔作用，在靶细胞膜上形成孔道，使得外泌体中的颗粒酶直接进入靶细胞。NK-Exo 进入靶细胞后可触发胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡和胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡。颗粒酶B可直接激活信号级联反应，破坏线粒体，释放细胞色素c，从而激活胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3 和胱天蛋白酶7，诱导胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡。颗粒酶A通过诱导线粒体应激反应，释放活性氧，导致单链DNA 损伤；同时，颗粒溶素直接损伤靶细胞膜并诱导内质网应激，从而介导胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡［50］。另外，在NK-Exo 中还可检测出FasL 的表达，FasL 通过与质膜上的Fas相互作用介导对靶细胞的细胞毒性作用［51］。因此，胱天蛋白酶信号传导、线粒体应激、内质网应激和Fas/FasL 信号通路在NK-Exo 诱导的细胞毒性反应中均发挥重要作用。

2.2 携带微RNA 诱导肿瘤细胞凋亡

miRNA 是一种单链非编码小分子RNA，其可通过结合位于转录本3′-非翻译区的互补序列来调节mRNA转录本翻译［52］。目前对NK-Exo中miRNA的研究较少。研究表明，携带肿瘤抑制性miR-186的NK-Exo 可通过下调神经母细胞瘤中的关键癌基因MYCN和极光激酶A 表达，抑制神经母细胞瘤细胞增殖；同时通过下调转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表达，减弱对NK 细胞的抑制作用，使NK 细胞继续发挥杀伤作用，最终诱导神经母细胞瘤细胞凋亡［48］。另有研究表明，NK-Exo中富含的miR-3607-3p 可通过靶向IL-26 抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制胰腺癌发展和恶性转化；同时发现，NK 细胞对胰腺癌细胞抑制作用也依赖于miR-3607-3p［53］。因此，NK-Exo 携带的miRNA 可通过调节相关靶基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。值得注意的是，NK-Exo的抗肿瘤活性已在体外和体内得到证实，而其对正常细胞生长无影响［51］。

2.3 免疫调节作用

有研究表明，肿瘤微环境中过表达的TGF-β 可以有效抑制NK 细胞活性，TGF-β下调NK 细胞表面活化受体NK 细胞蛋白30 和自然杀伤细胞G2 家族（NK cell G2 family，NKG2）并降低肿瘤细胞表面NKG2 配体的表达，从而产生抑制性免疫环境［54］。除细胞毒性作用外，NK 细胞还通过释放外泌体发挥免疫调节作用，NK-Exo 通过旁分泌作用或远距分泌作用靶向免疫系统，减轻肿瘤细胞的免疫抑制作用。

NK-Exo 可激活免疫细胞。NK-Exo 与外周血单个核细胞共培养24 h 后，CD3+亚群中CD25+T细胞比例升高，细胞因子释放增强，T 细胞激活增加。在免疫抑制条件下，NK-Exo 能够激活单核细胞、T 细胞和NK 细胞［55］，同时促进巨噬细胞中M1极化，增加诱导型一氧化氮合酶表达，同时抑制精氨酸酶1 活性［56］。此外，NK-Exo 可活化NK 细胞，经过神经母细胞瘤细胞预暴露处理的NK-Exo 活化NK细胞表面天然细胞毒性受体（natural cytotoxicity receptor，NCR），并使NK 细胞高表达NCR，对神经母细胞瘤细胞有更高的细胞毒性［57］。最近有研究表明，NK-Exo 可将TGF-β 抑制剂和硒代半胱氨酸共同运送到小鼠肿瘤组织，与NK 细胞协同作用，在小鼠体内增强抗癌功效［58］。还有研究发现，NK-Exo 可降低CD3/CD28 刺激的T 细胞上PD-1表达［55］，逆转肿瘤微环境对T 细胞的免疫抑制，使T 细胞恢复正常激活状态，恢复免疫系统抑制肿瘤的能力。

综上所述，NK-Exo 在杀伤肿瘤细胞的同时能够调节免疫反应，逆转肿瘤免疫抑制，增强抗肿瘤免疫，使其成为肿瘤免疫治疗的候选药物。对于实体瘤低氧且酸性的肿瘤微环境来说，注入NK 细胞进行肿瘤治疗最大的缺陷是NK 细胞无法有效的归巢到肿瘤发生部位［59］；同样，一些肿瘤细胞通过酸性肿瘤微环境下调NK 细胞表面受体表达而抑制穿孔素/含颗粒酶颗粒释放和Fas/FasL 相互作用，进而抑制NK 细胞的细胞毒性作用［60］。有研究表明，酸性肿瘤微环境促进肿瘤细胞摄取外泌体［61］。同时NK-Exo 可利用其纳米级尺寸和较低的免疫原性进入肿瘤微环境，在细胞间或细胞与环境之间进行交流。因此，未来的抗肿瘤策略可能基于NK-Exo，克服基于细胞治疗引发的所谓“细胞因子风暴”的风险。NK-Exo 的异质性会导致质量控制标准和治疗剂量不统一，进而造成实验结果可重复性差，治疗效果差异大。此外，我国目前尚无外泌体制剂制备的管理规范，使用不同制备工艺、不同设备生产的外泌体很可能具有不同的特性和功能。虽然NK-Exo 在模型小鼠中表现出良好的肿瘤靶向性，但其也可聚积在正常组织或器官［62］，因此需进一步提高其靶向能力。另外，天然分泌的NK-Exo 产量较低。总之，NK-Exo 的异质性、规模化和规范化生产及储存亦是其临床应用必须克服的难题。

3 OV与NK-Exo联合治疗肿瘤的可能性

OV 与放疗、化疗、免疫疗法和细胞疗法等联合疗法均取得了显著的治疗效果，提示在今后研究中，可考虑OV 与NK-Exo 联合治疗，将具有肿瘤特异性复制能力、刺激有效抗肿瘤免疫应答的OV 与可直接杀伤肿瘤细胞、调节免疫反应、下调免疫检查点表达的NK-Exo 相结合，通过恢复免疫活性、提高杀伤作用以促进OV 对肿瘤细胞的细胞毒性作用，最大程度提高肿瘤治疗效果，弥补单一疗法的不足。因此，需进一步通过非临床和临床研究，确定OV 与NK-Exo 联合治疗是否可通过协同作用诱导抗肿瘤反应并减少免疫抑制细胞浸润而最大限度地发挥抗肿瘤效果。