HPLC测定驱虫药中二氯苯醚菊酯和吡虫啉的含量

刘冠麟,姜淋洁,王 建,杨孝君,马吉飞

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300380;2.天津市中升挑战生物科技有限公司,天津 300080)

二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂是一种用于治疗预防动物体外寄生虫病的复方药物,直接涂抹在动物脊柱皮肤上,有效抵抗犬体表蚤、蜱、虱的寄生,抑制白蛉、厩蝇和蚊子的叮咬,辅助治疗过敏性皮炎[1],其中有效杀虫成分是二氯苯醚菊酯和吡虫啉,药物通过昆虫吸食给药动物血液进入虫体,干扰神经离子通道,从而达到杀虫作用,持续驱虫效果长达28 d[2-7]。

目前德国拜尔公司已上市的驱虫类产品除了拜宠爽(滴剂),还有爱沃克(滴剂)、旺滴静(滴剂)、索来多(项圈),主要成分为吡虫啉和其他杀虫药。近年来,国内已有此类杀虫滴剂仿制药的项目开发,经查阅文献,仅有检测农药中二氯苯醚菊酯和吡虫啉的方法[8-15],但作为兽用驱虫药的含量测定方法目前鲜见相关研究报道,因此该研究建立一种高效液相色谱法(HPLC)同时检测二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂中二氯苯醚菊酯和吡虫啉的含量方法,为二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂的质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂二氯苯醚菊酯对照品(G1050294,99.73%,Dr.Ehrenstorfer);吡虫啉对照品(G988243,98.55%,Dr.Ehrenstorfer);二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂(批号202204003、202204004、202204005,天津市中升挑战生物科技有限公司);甲酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯,天津市川普伟业科技有限公司);甲酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);超纯水。

1.2 仪器安捷伦1260Ⅱ高效液相色谱仪,包括G7111A四元泵、G7129A自动进样器、AT-330柱温箱、G7115A DAD检测器、C.01.07 SR2(255)色谱工作站,美国安捷伦科技有限公司;ES225SM-DR电子天平,普利赛斯仪器有限公司;超声波清洗器,昆山仪器有限公司;真空泵,ASL仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1色谱条件。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(X-Terra C18,100 mm×4.6 mm,3.5 μm,批号02403032213653);以0.05 mol/L甲酸铵溶液(用甲酸调pH至4.5)作为流动相A,乙腈作为流动相B;按表1进行梯度洗脱;柱温为35 ℃;检测波长为235 nm;进样量为5 μL。

表1 流动相洗脱梯度Table 1 Mobile phase gradient elution

1.3.2溶液的制备。

1.3.2.1对照储备液。电子天平精密称定吡虫啉对照品100 mg,用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至25 mL,摇匀,配制成浓度为4.0 mg/mL吡虫啉溶液,作为吡虫啉对照储备液;电子天平精密称定二氯苯醚菊酯对照品500 mg,用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至50 mL,摇匀,配制成10 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液,作为二氯苯醚菊酯对照储备液。

1.3.2.2对照品溶液。精密移取“1.3.2.1”吡虫啉对照储备液1 mL,用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至10 mL,摇匀,配制成浓度为0.4 mg/mL吡虫啉溶液,作为吡虫啉对照溶液备用;精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯对照储备液2 mL,用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至10 mL,摇匀,配制成2.0 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液,作为二氯苯醚菊酯对照溶液备用。

1.3.2.3供试品溶液。由于药品溶液黏稠存在挂壁现象,不适宜使用移液枪,故采用质量称定移取。精密称定二氯苯醚菊酯和吡虫啉滴剂120 mg,用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定至25 mL,摇匀,作为供试品溶液备用。

1.3.2.4空白对照溶液。精密称定不含二氯苯醚菊酯和吡虫啉的空白制剂120 mg,用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至25 mL,作为空白对照溶液备用。

1.3.3专属性试验。按照“1.3.2”方法分别配制吡虫啉对照品溶液、二氯苯醚菊酯对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液,按照“1.3.1”色谱条件分别进样高效液相色谱仪,记录色谱图。

1.3.4精密度试验。按照“1.3.2”方法分别配制2种对照品溶液、6份供试品平行溶液,按照“1.3.1”色谱条件分别进样,记录色谱峰面积。

1.3.5稳定性试验。按照“1.3.2”方法配制2种对照品溶液、6份相同浓度滴剂供试品平行溶液,分别放置0、1、4、8、16、24 h后,按照“1.3.1”色谱条件分别进样,记录色谱峰面积。

1.3.6线性关系确定。

1.3.6.1二氯苯醚菊酯线性关系。精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯对照储备液4.0、5.0、6.0、7.5、9.0 mL用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至20 mL,按照“1.3.1”色谱条件分别进样,记录色谱峰面积,并以峰面积为y轴、进样浓度为x轴绘制标准曲线。

1.3.6.2吡虫啉线性关系。精密移取“1.3.2.1”吡虫啉对照储备液3、4、5、6、7 mL用流动相A-流动相B(10∶90)混合溶液定容至50 mL,按照“1.3.1”色谱条件分别进样,记录色谱峰面积,并以峰面积为y轴、进样浓度为x轴绘制标准曲线。

1.3.7加样回收率试验。分别移取适量“1.3.2.1”项对照储备液置25 mL容量瓶中,稀释定容为80%加样回收溶液(4 mL二氯苯醚菊酯+2 mL吡虫啉)、100%加样回收溶液(5 mL二氯苯醚菊酯+2.5 mL吡虫啉)、120%加样回收溶液(6 mL二氯苯醚菊酯+3 mL吡虫啉),备用,按照“1.3.1”色谱条件分别进样,记录色谱峰面积,计算加样回收率。

1.3.8定量限和检测限。移取“1.3.2.2”项中2种主药对照品溶液,逐步稀释,连续进样6次,记录二氯苯醚菊酯和吡虫啉信噪比平均数,以信噪比S/N为3时对应的浓度为检测限(LOD);以信噪比S/N为10时对应的浓度为定量限(LOQ)。

1.3.9耐用性试验。移取“1.3.2”项对照品溶液和供试品溶液各1份,供试品选用批号202204003样品,在“1.3.1”色谱条件下,通过改变流速(±5%)、柱温(±5 ℃)、流动相A 酸度(pH±0.2),换用不同批号的色谱柱(批号02403032213653、02413128113605),记录各个条件下主峰的分离情况。

1.3.10样品含量测定。移取“1.3.2.2”项对照品溶液,另选取3批不同批号(202204003、202204004、202204005)二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂样品,溶解稀释,按照“1.3.1”色谱条件进样2次,记录色谱峰面积,并采用外标法计算样品中2种药效成分含量结果。

2 结果与分析

2.1 专属性试验从吡虫啉对照品、二氯苯醚菊酯对照品、供试品、空白对照色谱图(图1)可以看出,吡虫啉出峰时间在2.5～3.0 min,二氯苯醚菊酯顺反异构体出峰时间在14～16 min,供试品与对照品出峰时间一致,且空白对照无主峰出现对含量测定无干扰,说明该色谱条件下专属性良好。

2.2 精密度试验精密度试验结果表明,二氯苯醚菊酯平均峰面积为10 763.4,RSD为0.17%,吡虫啉平均峰面积为5 936.7,RSD为0.52%,峰面积RSD均小于2%,表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验稳定性试验结果表明(表2),二氯苯醚菊酯平均峰面积为13 310.8,RSD为0.89%;吡虫啉平均峰面积为7 342.6,RSD为0.85%,2种主药成分峰面积RSD均小于1.00%,表明溶液稳定性良好。

2.4 线性关系从图2可以看出,二氯苯醚菊酯线性方程为y=6 030x-79.36(R2=0.999 8),表明二氯苯醚菊酯对照品溶液浓度在1.209 8～2.822 8 mg/mL时与峰面积线性关系良好;吡虫啉线性方程为y=15 746x+24.61(R2=1.000 0),表明吡虫啉对照品溶液浓度在0.237 5～0.554 2 mg/mL时与峰面积线性关系良好。

2.5 加样回收率从表3可以看出,二氯苯醚菊酯平均回收率为99.84%,吡虫啉平均回收率为100.33%,2种主药成分回收率RSD均小于1.00%,表明该方法准确性良好。

2.6 定量限和检测限试验结果表明,当S/N=10时,二氯苯醚菊酯浓度为2.447 μg/mL,吡虫啉浓度为0.082 μg/mL;当S/N=3时,二氯苯醚菊酯浓度为0.733 μg/mL,吡虫啉浓度为0.029 μg/mL。

2.7 耐用性试验按“1.3.9”方法操作,结果如表4所示,在各个条件下,主峰与各杂质峰均能分离,且二氯苯醚菊酯、吡虫啉含量的RSD均小于2.00%,试验结果说明流动相酸度、柱温、流速及不同批次色谱柱对含量检测无明显影响,表明该方法耐用性良好。

注:a、b、c、d分别为吡虫啉对照品、二氯苯醚菊酯对照品、供试品、空白对照。Note:a,b,c and d refer to imidacloprid reference substance,permethrin reference substance,test substance,and blank control,respectively.图1 专属性试验色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of specific test

表2 稳定性试验结果

图2 二氯苯醚菊酯(a)、吡虫啉(b)标准曲线Fig.2 Standard curves of permethrin (a) and imidacloprid (b)

2.8 样品含量测定经测定(表5),3批不同批号二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂样品中二氯苯醚菊酯和吡虫啉这2种药效成分含量分别为98.88%～100.80%、99.59%～100.89%,平均值分别为99.83%、100.12%,表明检测结果符合标准规定(95.0%～105.0%)。

3 讨论

经查阅文献,目前关于二氯苯醚菊酯和吡虫啉这2种药品的检测仅局限于农药[16-22],未见兽药制剂的含量检测,该研究对比多位国内外学者建立的二氯苯醚菊酯和吡虫啉的测定方法,结合二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂的药物性状对检测方法进行了优化,以求同时检测2种药品含量,建立了一种兽药制剂的HPLC检测方法。

以往的文献资料中[16-22],HPLC法检测二氯苯醚菊酯和吡虫啉含量色谱条件选用的流动相大多是高比例乙腈-水、甲醇-水,预试验中使用高比例甲醇-水和乙腈-水作为流动相峰形并不理想,所以该研究选用0.05 mol/L甲酸铵-乙腈溶液作为流动相,甲酸铵作为离子缓冲剂,有利于改善峰形,提高积分准确度,调节pH至4.5可以使出峰时间提前。另外,设置梯度洗脱可以有效防止二氯苯醚菊酯对吡虫啉出峰的干扰,以便更好地收集数据。在检测波长的选择时,Waleng等[23]检测吡虫啉时波长为268 nm,吴国旭等[24]研究发现2种主药的紫外最大吸收波长分别为吡虫啉270 nm、菊酯类225 nm,在预试验中检测到吡虫啉紫外最大吸收波长为270 nm,二氯苯醚菊酯最大吸收波长为210 nm,为了避免检测波长趋近于紫外最大吸收波长,兼顾2种成分最终确定235 nm为检测器适宜波长,已达到同时检测的目的。

表3 回收率考察结果Table 3 Recovery rate inspection results

表4 耐用性试验结果Table 4 Durability test results 单位:%

表5 样品含量测定Table 5 Sample content determination 单位:%

由于二氯苯醚菊酯和吡虫啉这2种主药都易溶于极性有机溶剂,国内外学者使用乙腈或甲醇稀释[16-26],为了提高分离度,减少传质阻抗,提高分离塔板数,该研究采用流动相和乙腈混合溶液作为稀释剂,可以使峰形尖锐对称,出峰时间稳定。

4 结论

该研究建立了同时检测二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂中2种药效成分的分析方法,分别对其专属性、精密度、稳定性、线性关系、加样回收率、方法耐用性和含量测定进行了方法学试验,结果良好,2种主药含量平均值分别为99.83%和100.12%,符合检测标准。综上,该方法适用于二氯苯醚菊酯吡虫啉滴剂药效成分的含量检测,为新型兽药驱虫剂产品质量标准提供参考。