大蒜、洋葱提取液在防治香菇常见病害细菌的应用研究*

谭 波,黄坤宁,杨久玲,申 鹰

(1贵州省检测技术研究应用中心,贵州 贵阳 550000;2贵州省分析测试研究院,贵州 贵阳 550000)

0 引言

香菇(Lentinusedodes)作为中国传统食用菌之一,是世界第二大栽培食用菌[1]。香菇不仅营养丰富而且具有很高的食药用价值和保健功能[2-6],在我国食品产业中占有较大的比重。“十三五”时期,我国香菇产业发展迅速,香菇产量占全球香菇总产量的95%以上,是我国总产量最高、生产区域最广、影响最大的食用菌产品[7]。然而,香菇在菌袋出菇过程中经常受到芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌等细菌的危害,导致香菇子实体停止生长,菌盖、菌柄及菌褶褐变、腐烂并散发恶臭,菌丝体生长发育异常[8-9],出菇率下降,对香菇的产量和质量造成严重的影响。

大蒜(AlliumsativumL.)属百合科葱属,多年生草本植物,具有很多生物活性物质,其提取物对多种球菌、杆菌、真菌和病毒都有不同程度的抑制和杀菌作用[10-13]。洋葱(AlliumcepaL.)属百合科葱属,二年生草本植物,含有各种有效的抑菌成分,其提取物可抑制葡萄球菌属、链球菌属、弧菌、芽孢杆菌等多种微生物的生长[14-17]。近年来,随着生物农药研究的兴起,大蒜、洋葱提取物对病原菌的抑菌作用成为国内外研究热点。大蒜和洋葱提取物正逐步在食品中得到应用,均主要集中在食品保鲜和品质影响[18-24],而对香菇菌种生长影响及其在香菇杂菌抑制效果方面少有报道。在当前倡导无公害、无污染、无农药残留的发展背景下,解决香菇菌种的杂菌污染问题,寻找一种“绿色药剂”,进行杂菌防治显得尤为重要。本试验通过研究大蒜、洋葱提取液及其混合液对香菇常见的病原细菌的抑制效果,及对香菇菌丝生长的影响,旨在研究从源头防控香菇病原细菌危害的方法,为香菇产业的持续高质量发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇(CICC14019)、香菇(CICC14030)、香菇(CICC14009),中国工业微生物菌种保藏管理中心;枯草芽孢杆菌[Bacillussubtilis,CMCC(B)63501]、蜡样芽孢杆菌[Bacillus cereus,CMCC(B)63303]:-20 ℃冻存,荧光假单胞菌(P.Fluorescens,ATCC13525):常温液体石蜡封存,广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心食品安全菌种保藏中心。

95%乙醇,分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、营养琼脂(NA),广东环凯微生物科技有限公司;氯化钠(NaCl),分析纯,成都金山化学试剂有限公司;大蒜、洋葱购自贵州省贵阳市白云区。

1.2 仪器与设备

组织研磨机,Tube MILL control,IKA;电子天平,LT2002,常熟市天量仪器有限责任公司;生化培养箱,BSP-250,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;蒸汽灭菌器,SX700,KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC(日本);生物安全柜,Ⅱ级A2,赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司;旋转蒸发仪,RE-2000A,上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵,SHB-Ⅲ,郑州长城科工贸有限公司;超声波清洗器,SK250HP,上海科导超声仪器有限公司;台式低速离心机,L550,长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取液制备

将洋葱、大蒜各去掉外皮,分别用组织研磨机研碎,40 ℃酶解30 min,与95%乙醇按照质液比1∶2的比例充分混匀,在35 ℃水浴下超声提取45 min,离心10 min后收集上清液,利用旋转蒸发仪减压浓缩,得到浸提液母液,浓度为2 g/mL,过滤除菌,冷藏储存备用。

1.3.2 菌种复壮及菌悬液制备

将冻存的枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌从冰箱取出恢复至室温,将其和荧光假单胞菌分别接种于营养琼脂培养基,培养一天得到试验菌株,使用无菌棉签挑起经复壮后的试验菌株单个菌落于9 mL无菌生理盐水制成0.5麦氏比浊度浓度的菌悬液,再用9 mL无菌生理盐水将其稀释为106CFU / mL试验菌株菌悬液。

1.3.3 培养基制备

生理盐水:称取8.5 g氯化钠溶于1000 mL纯水中,分装,121 ℃高压灭菌15 min,冷却后备用。

营养琼脂:称取营养琼脂3.3 g,加入100 mL纯水溶解,121 ℃高压灭菌15 min,50 ℃保温备用。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:称取PDA 4.01 g,加入100 mL纯水溶解,121 ℃高压灭菌15 min,50 ℃保温备用。

1.3.4 抑菌试验

用无菌水将大蒜、洋葱提取液稀释,制成终浓度分别为2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL的提取液。同时按照大蒜和洋葱的提取液比例为1∶1,1∶3,1∶7,3∶1混合。取1 mL“1.3.2”中制备的各试验菌株菌悬液于营养琼脂培养基混匀,倒15～20 mL至平板,待平板凝固后,在平板上等距离放置4个灭菌牛津杯,在牛津杯中加入0.2 mL提取液,每个提取液做3个重复,同时用无菌水做空白对照。37 ℃培养18 h,采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.3.5 大蒜、洋葱提取液对香菇菌丝生长影响试验

分别取浓度为2 g/mL的大蒜、洋葱提取液及其混合液31.25 μL、62.5 μL、125 μL、250 μL、500 μL、1000 μL、2000 μL、4000 μL与100 mL PDA培养基混匀倒入培养皿,分别制成含提取液终浓度为0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、80 mg/mL的PDA平板备用,用不加提取液的PDA培养基作为空白对照。接种直径为0.5 cm的香菇菌丝块,25 ℃培养4～8 d,采用十字交叉法测量菌落直径,当空白对照菌落直径达培养皿的2/3时,按以下公式计算相对抑制率(%):

相对抑制率=

1.4 数据分析

采用Excel 2019软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 大蒜、洋葱提取液及其混合液对香菇中常见病害细菌抑菌效果

采用“1.3.4”方法对各浓度的大蒜、洋葱提取液及其混合液分别开展抑菌试验,结果见表1-表3。

表1 大蒜提取液对香菇中常见病害细菌的抑菌效果

表2 洋葱提取液对香菇中常见病害细菌的抑菌作用

表3 大蒜、洋葱混合提取液对香菇中常见病害细菌的抑菌作用

表1-表3结果显示,大蒜、洋葱提取液及其混合液均对香菇常见病害细菌有抑菌作用,抑菌效果为大蒜提取液>混合液>洋葱提取液。大蒜提取液对3种香菇常见病害细菌均有较强的抑菌作用,且抑菌效果为蜡样芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌>荧光假单胞菌。洋葱提取液仅对芽孢杆菌有抑菌作用,且对两种芽孢杆菌的抑菌效果相当。大蒜、洋葱混合液对3种病害细菌均有抑菌作用,随着大蒜浓度的增加抑菌效果也随之增强;但对3种细菌的抑菌效果与单一的大蒜或洋葱提取液的不同,其抑菌效果为枯草芽孢杆菌>蜡样芽孢杆菌>荧光假单胞菌。

2.2 大蒜、洋葱提取液及其混合液对香菇菌丝生长的影响

采用“1.3.5”的试验方法,取各浓度的大蒜、洋葱提取液及其混合液分别对3种香菇菌种开展菌种生长试验,结果见表4-表6;各提取液对3种香菇菌种菌丝抑制效果见图1-图3。

图1 大蒜、洋葱提取液及混合液对CICC14030的抑制效果

图2 大蒜、洋葱提取液及混合液对CICC14019的抑制效果

图3 大蒜、洋葱提取液及混合液对CICC14009的抑制效果

表4 大蒜提取液对香菇菌丝生长的影响

表6 大蒜、洋葱混合提取液对香菇菌丝生长的影响

以上结果显示,单一的大蒜提取液对3种香菇菌丝生长均有不同程度的影响,随着大蒜提取液浓度的增加,对香菇的抑制作用也逐渐增强;大蒜提取液浓度<5 mg/mL,抑制效果为CICC14019>CICC14030>CICC14009;大蒜提取液浓度>5 mg/mL,3种香菇菌丝均停止生长。单一的洋葱提取液在高浓度时才对3种香菇有明显的抑制作用,抑制效果为CICC14019>CICC14030>CICC14009,在适当的洋葱提取液浓度下,对香菇CICC14009有一定的促生长作用;当洋葱提取液浓度在1.25～20 mg/mL时,对香菇CICC14009具有促生长作用,且在浓度为1.25～10 mg/mL时,随着洋葱提取液浓度的增加,促生长作用也随之增强。

大蒜、洋葱提取液的混合液对3种香菇的影响效果与单一的大蒜、洋葱提取液对3种香菇的影响效果相当,主要表现为随着大蒜提取液含量比例的增加,对3种香菇的抑制效果增强;随着洋葱提取液含量比例的增加,对3种香菇的抑制效果减弱。

3 结论

大蒜、洋葱提取液及其混合液对香菇病害细菌均有抑菌作用,大蒜提取液的抑菌效果强于洋葱提取液的抑菌效果;大蒜提取液对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌均有抑菌作用,洋葱提取液仅对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌有抑菌作用,对荧光假单胞菌无抑菌作用。对香菇菌丝生长的影响根据香菇菌种的不同抑制效果也不相同,主要为大蒜提取液对香菇菌丝的抑制效果强于洋葱提取液对香菇菌丝的抑制效果;大蒜提取液对3种香菇的抑制效果为CICC14019>CICC14030>CICC14009,洋葱提取液在高浓度时对3种香菇有明显抑制作用,在低浓度时对香菇CICC14009菌丝生长有促进作用。试验结果表明,大蒜、洋葱提取液均有抑菌作用,可作为天然抑菌剂开发应用;洋葱提取液具有改良香菇生长培养基的潜力。

由于天然抑菌剂具有绿色安全、无毒无害、无抗药性等优点,随之被广泛的应用于农业、医学、食品等领域,越来越多的天然抑菌剂被发现,本实验用大蒜及洋葱提取液作为抑菌剂,开展防治香菇病害细菌的研究,为今后的相关研究提供参考,以提高食用菌产业防治食用菌细菌性病害的水平,促进食用菌产业的高质量持续发展。