9种花椒果实的挥发性成分比较分析

黎礼谦, 张付豪, 罗英舰, 郑元利, 杨玉霞, 姚华开

(遵义市农业科学研究院, 贵州 遵义 563000)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)为芸香科花椒属落叶小乔木或灌木,主要生长于我国的四川、贵州、陕西、重庆等省(市),是一种药食同源的木本油料树种。花椒香气浓郁、味辛麻,果皮可用作调料,也可入药,用于治疗胸部、腹部及胃的寒痛等[1]。目前,我国花椒约有45种,各品种花椒的风味评价及生长环境亦有所差异,而花椒的风味评价主要受其香气成分及辛麻味的影响[2]。

花椒香气主要源于花椒果皮中的柠檬烯、桧烯、芳樟醇、月桂烯、乙酸松油酯、桉树脑等120余种[3]挥发性物质,这些物质在医药方面具有麻醉、止痛、逐寒、抗肿瘤等功效[4]。不同地区和品种的花椒香气类型不同,主要原因是其所含的挥发性物质种类及含量有所差异[5]。蒲凤琳等[6]通过特征香气主成分分析,证实了在四川汉源、重庆江津等4个地区的青花椒中存在着相似和不相似的香气成分物质。樊丹青等[7]研究发现,不同产地的花椒挥发油中主要香气成分含量差异显著。目前,常见的植物酰胺类物质的测定分析方法主要有气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)[8]、电子鼻技术[9]、气相色谱技术[10]、超高效液相色谱串联质谱分析[11]、红外光谱法[12]和分光光度法[13]等。本研究以我国花椒盛产地的9种花椒为试验品种,采用气相色谱-质谱联用分析技术,结合聚类分析和主成分分析等对9种花椒挥发性成分进行比较分析,为进一步探究我国各地花椒品种的品质差异,促进优质花椒品种选育及花椒产品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

9个试验品种由遵义市农业科学研究院花椒试验基地提供,品种及样品编号见表1。

表1 9种花椒样品信息

1.2 试验方法

1.2.1样品前处理

顶空进样参数:称取适量花椒样品放于顶空瓶中,密封后转移至80 ℃水浴锅加热0.5 h,用固相微萃取针萃取样品0.5 h,将萃取针放至进样口解吸5 min。

GC条件:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气流速:1.0 mL/min;四级杆温度:180 ℃;进样口温度:250 ℃;分流比:不分流。升温程序:起始温度:45 ℃,保持时间4 min,以6 ℃/min的速率升至130 ℃,保持时间6 min,再以10 ℃/min的速率升至230 ℃,保持时间8 min。

MS条件:电子轰击源;离子源温度:230 ℃;接口温度:250 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围:35～500 m/z

1.3 数据处理

1.3.1GC-MS数据分析

在NIST17标谱库中对采集到的质谱图进行检索,选取其中匹配度大于80%的物质,通过面积归一化法分析各成分的相对含量。以检测到的物质保留时间为有效响应点,以保留时间-峰面积归一化法为数据集,对花椒挥发性成分进行定性定量分析。

1.3.2聚类分析

利用组间连接法,探究花椒样品中挥发性成分的构成种类及含量之间的差异性。

1.3.3主成分分析

采用SIMCA14.1软件对花椒样品中的挥发性成分进行主成分分析,通过在PCA散点图中转换得PCA第1主成分和第2主成分贡献率,计算两者的总贡献率。一般总贡献率超过70%,说明主要成分具有代表性,以此确定花椒中主要特征风味成分[14-15]。

2 结果与分析

2.1 9种花椒挥发性成分及含量分析

采用GC-MS方法分析,对9种花椒挥发性成分进行测定,鉴定出挥发性成分137种,占挥发油含量的98.55%～99.51%,其中,包含烃类 (55种)、醇类(36种)、酯类 (21种)、醛类 (7种)、酮类 (10种)及其他 (8种),9种花椒挥发性成分中共有成分26种,非共有成分111种。9种花椒各自的挥发性成分构成及相对含量如图1所示,由图1A可知,ZBM9中检测出的挥发性成分种类最多,为83种;其次为ZBM5和ZBM6,均检测出82 种;ZBM8、ZBM7、ZBM4、ZBM3、ZBM1和ZBM2分别为80种、79种、78种、75种、73种和70种。在9种花椒挥发性成分中,烃类及其衍生物种类最多,醇类以及酯类物质种类占比次之;醛类、酮类和其他类物质较少。

注:A为9种花椒各类别挥发性物质成分堆积图;B为9种花椒挥发性成分类别及相对含量。

如图1B所示,9种花椒各种物质相对含量差异明显,ZBM1中醇类、脂类相对含量最高(51.22%和26.62%),烃类物质次之(20.07%),醛酮类及其他物质均不足1.5%。其余花椒品种均以烃类、醇类物质相对含量最高(26.22%～56.96%和36.06%～58.63%),酯类物质次之(2.82%～18.03%),醛酮类物质较少(0.16%～3.04%),其他类物质相对含量最低,小于1.5%。结合表2、表3可知,9种花椒相对含量较高的挥发性成分主要有括D-柠檬烯、大根香叶烯-D、芳樟醇、β-月桂烯等单萜类化合物和乙酸芳樟酯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己醇乙酸酯、乙酸松油酯等。通过查阅相关文献可知[16-17],花椒中香气活性物质主要有提供植物、柑橘、柠檬等香气的萜烯类氧化物,提供甜香、果香的脂类化合物以及提供椒麻味、典型胡椒香气的胡椒酮、芳樟醇类化合物等。鉴于9种花椒烃类、醇类及脂类之间种类数量及含量差异,说明9种花椒间的香气存在差异[18],这与陈光静等[19]的研究结果相似。

表2 9种花椒共有挥发性成分及其相对含量

表3 9种花椒非共有挥发性主要成分及其相对含量

2.1.19种花椒共有挥发性成分分析

如表2所示,9种花椒中包含26种共有挥发性成分,主要为崖柏烯(1.85%～4.99%)、β-月桂烯(3.18%～7.08%)、α-水芹烯(0.57%～2.12%)、4-蒈烯(0.64%～2.71%)、3,6,6-三甲基-2-降蒎烯(1.69%～4.46%)、γ-松油烯(1.27%～6.55%)、α-蒎烯(0.03%～0.36%)、β-蒎烯(0.02%～0.11%)、大根香叶烯-D(1.02%～6.04%)、Δ-杜松烯(0.23%～2.55%)、Α-杜松烯(0.02%～0.28%)在内的11种烃类物质;桉叶油醇(3.85%～9.00%)、芳樟醇(0.03%～35.10%)、反式-4-侧柏醇(0.14%～37.07%)、4-萜品醇(1.12%～5.74%)、异胡薄荷醇(0.02%～0.08%)、T-杜松醇(0.26%～0.82%)在内的6种醇类;乙酸异戊酯(0.05%～0.12%)、Δ-乙酸松油醇酯(0.07%～0.73%)、乙酸桃金娘烯酯(0.05%～0.31%)、乙酸松油酯(1.36%～12.81%)、乙酸橙花酯(0.02%～0.26%)、棕榈酸甲酯(0.02%～0.04%)等在内的7种酯类;以及2-乙基呋喃(0.18%～0.82%)和石竹素(0.02%～0.13%)两种其他成分;这与孟佳敏等[20]关于花椒风味物质的研究结果相比,主要挥发性成分种类相对一致,但其相对含量具有一定差异。

鉴定出的26种共有成分占各花椒挥发油总含量的63.46%～85.81%,其中主要共有成分(相对含量>1%) 相对含量相差较大。如表2和图2所示,26种共有挥发性成分主要为醇类和烃类物质,分别占31.51%～53.17%和14.39%～25.81%;烃类物质当中萜烯类物质占比较大,为12.64%～21.18%。9种花椒检测出的主要共有成分有崖柏烯、β-月桂烯、桉叶油醇、3,6,6-三甲基-2-降蒎烯、γ-松油烯、芳樟醇、反式-4-侧柏醇、乙酸松油酯、大根香叶烯-D、Δ-杜松烯等。

图2 9种花椒共有挥发性成分类别及相对含量

这些主要共有成分在9种花椒中相对含量均比较高,差异较为明显,且香气阀值较低,大部分为花椒中重要的香味物质[21]。如芳樟醇香气阀值为10 bpm,具有浓厚的柑橘香、玫瑰木香、铃兰与玫瑰的花香[22];β-月桂烯香气阀值为13～15 bpm,具有清淡的香脂香气[23];桉叶油醇具有草药、松油、樟脑的气息[24];乙酸松油脂具有一定的木香和花香;反式-4-侧柏醇和大根香叶烯-D具有强烈的膏香、木清香[25];崖柏烯具有药草青香[26];4-萜品醇则赋予品种花香及菠萝香、梨香等果香[27]。9种花椒中ZBM1和ZBM2中的共有挥发性成分含量类似,均以芳樟醇含量最高(35.10%和26.40%),桉叶油醇(8.68%和6.94%)、β-月桂烯(3.53%和6.82%)和崖柏烯(2.61%和3.71%)含量次之,其他成分相对较少,因此,这两种花椒的香气以浓厚的柑橘香、玫瑰木香为主,辅杂着少量的草药、松油香脂的气息。但ZBM1中含有4.03%的4-萜品醇,故还有淡淡的果香味。ZBM3～ZBM6、ZBM8和ZBM9中反式-4-侧柏醇含量最高,分别为37.07%,18.69%,35.19%,18.27%,22.45%,21.52%,其次为芳樟醇、桉叶油醇、β-月桂烯、崖柏烯和乙酸松油脂,相对含量均为3%～10%,其他成分含量相对较低,故这6种花椒以强烈的膏香、木清香为主,辅杂着一些柑橘香、花香及草药香,但ZBM6、ZBM9中分别有3.97%和5.74%的4-萜品醇,故带有一丝果香。ZBM7中共有挥发性成分相对含量最高的为反式-4-侧柏醇(27.4%)、乙酸松油脂(12.81%),其次为桉叶油醇(9.0%)和大根香叶烯-D(6.04%),但其几乎不含芳樟醇(0.03%),故其仍以膏香、木清香和花香为主,辅杂着少量的草药香、松油香。这些共有化合物在9种花椒中的含量差异是造成不同花椒香气差异的主要原因。

2.1.29种花椒非共有挥发性物质成分及含量分析

鉴定出的111种非共有成分主要为烃类、醇类、酯、醛酮类,这些非共有成分数量占比高于共有挥发性成分,但其相对含量基本低于共有挥发性成分。

如图3A所示,9种花椒非共有挥发性成分中烃类、醇类、酯、醛酮类物质数量规律和共有成分类似,烃及其衍生物数量最多,其次是醇类、醛酮类和脂类,其他物质数量最少。由图3B可知,9种花椒非共有挥发性成分相对含量有所差异,ZBM2～ZBM5、ZBM7中,以烃类相对含量最高(5.78%～38.28%),醇类、脂类物质次之(2.28%～7.64%和0.38%～3.53%),醛酮类及其他物质均不足1.5%;ZBM1以脂类非共有挥发性成分最高(24.86%),烃类、醇类物质次之(5.68%和2.56%),醛酮类及其他物质不足1.5%;ZBM8和ZBM9以烃类物质相对含量对多,脂类物质次之,醇类物质较少,醛酮类及其他类物质均不足1.5%。而醇类物质的香气多为花香、醇香,烃类物质所散发的香气多为松节油香和木香,脂类物质则以浓郁的奶油/奶酪香气为主[28],这进一步说明9种花椒的香气存在差异。

注:A为9种花椒各类别挥发性物质成分堆积图;B为9种花椒挥发性成分类别及相对含量。

如表3所示为110种非共有挥发成分中相对含量大于1.5%的物质(其中1种花椒的相对含量大于1.5%即统计)。由表3可知,9种花椒的非共有挥发性主要物质有D-柠檬烯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己醇乙酸酯、乙酸芳樟酯、α-松油醇、L-α-松油醇、罗勒烯和胡椒酮等,且这些物质的相对含量在9种花椒间有所差异,且香气阀值较低。如D-柠檬烯香气阀值为10 bpm,具有橙皮香味,罗勒烯具有花草香和橙花油的气息,胡椒酮具有类似薄荷和樟脑的香气[29]。D-柠檬烯在ZBM2中相对含量为32.54%,在ZBM4、ZBM6、ZBM8中含量分别为13.69%,18.08%和15.89%,在其他几种花椒中没有检测出;1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己醇乙酸酯仅在ZBM1、ZBM3中检测出,ZBM1中的相对含量远大于ZBM3(23.22%>0.09%),罗勒烯和胡椒酮分别仅在ZBM3和ZBM6中检测出,其含量分别为2.61%和2.39%。因此,9种花椒除共有挥发性成分所散发的香气外,ZBM4、ZBM6和ZBM8也具有较为浓烈的橙香味,ZBM2则橙香味更浓;ZBM6中也带有一丝少量的薄荷香气。另外,在9花椒品种中还存在许多相对含量小于1.5%的非共有挥发性成分,如仅在ZBM1和ZBM9中检测到的对薄荷-1,3,8-三烯和仅在ZBM1和ZBM2花椒样品中检测到的顺式橙花醇等,这些不同品种花椒的特有成分也可能是造成它们气味差异的原因。

2.2 聚类分析

将9种花椒共有挥发性成分相对含量作为变量,采用系统聚类对9种花椒样品进行聚类分析。结果见图4,可将9种花椒聚为3组,ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8聚为一组,ZBM1和ZBM2聚为一组,ZBM6和ZBM9聚为一组。

图4 基于共有挥发性成分的9种花椒系统聚类分析

在ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8一组中检出的挥发性物质相对含量在1%以上的平均有11种,烃类最多,均在20%左右;其次是醇类,值得注意的是,其中反式-4-侧柏醇含量均为最高,分别为37.07%,18.69%,35.19%,27.40%和22.45%,因此这5种花椒可归为一类。ZBM1和ZBM2一组的相对含量在1%以上的挥发性物质均为10种,其中芳樟醇含量均为最高,分别为35.10%和26.4%;桉叶油醇含量次之,分别为8.68%和6.94%。说明这两种花椒挥发性物质成分具有较高的相似性,且物质相对含量差异较小。ZBM6和ZBM9一组的相对含量在1%以上的挥发性物质均为10种,各类挥发性物质含量非常相近,其中含量最高的均为反式-4-侧柏醇,分别是18.27%和21.52%。这些结果表明,系统聚类分析能够将这9种不同花椒品种很好的区分并且归类,组内挥发性物质成分相似度较高,组间有较明显的差异。

2.3 主成分分析

通过对9种花椒的关键风味化合物进行主成分分析,得出不同产地花椒关键风味化合物的主成分分析(图5),得分图和载荷图反映了关键风味化合物对主成分的影响程度大小,确定了9种花椒的主要风味物质特征。由图5A可知,9种不同产地花椒仍然可以有效区分为三组,其中ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8聚为一组,ZBM1和ZBM2聚为一组,ZBM6和ZBM9聚为一组,与上述聚类分析结果一致。从坐标看,样品间越接近说明他们之间的气味越相近,挥发性成分越相同,反之说明气味差异越大[30]。由此看出这9个品种花椒组内香气特征相似度较高,组间各个花椒有较明显的差异。综合聚类分析与主成分分析的结果来看,四川、贵州及重庆的这几种花椒挥发性成分类别及相对含量基本相似,且西南地区的气候环境等因素也较为相同,因此这几个地方的花椒易于相互引种栽培,并开展良种选育等相关研究,而陕西等西北地区的花椒品种则与西南地区的这几种花椒区别较大,可能不适宜在西南地区种植。

注:A为得分图;B为载荷图。图B中1～137表示9种花椒检测出的137种挥发性成分。

如图5B所示,2个主成分因子PC1(25.2%) 和PC2(46.8%) 的累积贡献率达到72%,说明可以用2个因子代替原来的数据来评价9个不同产地花椒的香气品质。PC1中载荷值正向较高的成分序号为32((1R,3R,4R,5S)-1-异丙基-4-甲基双环[3.1.0]己烷-3-乙酸乙酯)、28 ((Z)-胡椒醇),它们的载荷值分别是0.135和0.137;负向较高的是37(2-氧杂环[2.2.2]辛烷-6-醇,1,3,3-三甲基,乙酸酯)和104 (8-乙酰氧香芹艾菊酮),它们的载荷值分别是-0.162和-0.157;PC2中载荷值正向较高的分别是序号为40 (α-蒎烯)、58 (Δ-杜松烯),它们的载荷值分别是0.179和0.178;负向较高的是20 (α-侧柏酮)、49 (顺式橙花醇),它们的载荷值分别为-0.129和-0.125。化合物远离坐标轴原点表明这个化合物对主成分有强烈的影响,说明这些物质对这9种花椒整体香气贡献度相对较大。综合第1主成分和第2主成分,如图5B所示,从两个主成分方向上的坐标位置来看,序号为19 (芳樟醇)、22 (反式-4-侧柏醇)、32((1R,3R,4R,5S)-1-异丙基-4-甲基双环[3.1.0]己烷-3-乙酸乙酯)、38 (乙酸松油酯)、102 (大根香叶烯B)这5种物质在第1主成分和第2主成分的特征向量绝对值较其他物质高,整体香气贡献度大。值得注意的是,其中芳樟醇、反式-4-侧柏醇、乙酸松油酯这3种物质含量在9种花椒样品中总体占比较大,为9种花椒香气特征的形成提供物质基础;同时,这几种物质的含量也存在差异,ZBM1、ZBM2中芳樟醇含量最高,达35.1%、26.4%,但反式-4-侧柏醇的含量却很低,均小于1%。ZBM3-ZBM9的芳樟醇含量较低,但反式-4-侧柏醇含量均在10%以上,其中ZBM3最高为37.07%。ZBM5和ZBM7中乙酸松油酯的含量则最高,分别是9.67%和12.8%。

这些具有不同特征香气的物质不仅共同构成了不同产地花椒的主体香气,还可能是区分不同产地花椒的关键化合物。ZBM1和ZBM2的芳樟醇含量远远高于其他几种花椒,说明ZBM1和ZBM2在多种挥发性香气物质形成的复合香气特征中表现出具有突出的柑橘香,玫瑰木乡香,区别于其他花椒;ZBM3-ZBM9乙酸松油酯含量高于ZBM1和ZBM2,木香和花香、膏香较为突出;其中ZBM6和ZBM9的芳樟醇含量高于另外5种花椒,仅次于ZBM1和ZBM2,说明这2种花椒除了具有较为突出的木香和花香,柑橘香和甜香味也比较浓郁。同时,除了这些香气贡献度较大的成分,其余挥发性香气物质为花椒的整体香气也起到一定的辅助作用。

3 结论与讨论

本研究通过气质联用分析对9种花椒的挥发性成分进行了分析,共鉴定出137种挥发性成分,其中,烃类55种、醇类36种、酯类21种、醛7种、酮类10种及其他8种。9种花椒品种内的挥发性成分数量有所差异,ZBM9中检测出的挥发性成分种类最多,ZBM5和ZBM6次之,ZBM2最少。在9种花椒挥发性成分中,以烃类及其衍生物种类最多,醇类以及酯类物质种类占比次之;醛类、酮类和其他类物质较少。9种花椒共存在26种共有成分,其相对含量差异较大。在ZBM1和ZBM2共有挥发性成分中,芳樟醇相对含量最高,呈浓厚的柑橘香、玫瑰木香;ZBM3～ZBM6、ZBM8和ZBM8中反式-4-侧柏醇相对含量最高,呈强烈的膏香、花香及木香;ZBM7中以反式-4-侧柏醇、乙酸松油脂含量最高,呈膏香及花木香。9种花椒非共有成分有111种,主要成分有D-柠檬烯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己醇乙酸酯、乙酸芳樟酯、松油醇、罗勒烯和胡椒酮等。除共有挥发性成分所散发的香气外,ZBM4、ZBM6和ZBM8中由于含有较多的D-柠檬烯,所以具有较为浓烈的橙香;ZBM6中由于含有少量的胡椒酮,所以带有一丝薄荷香气。另外,在9花椒品种中还存在许多相对含量小于1.5%的非共有挥发性成分,这些特有成分也对花椒的香气产生影响。聚类分析和主成分分析结果显示,ZBM3、ZBM4、ZBM5、ZBM7和ZBM8聚为一组,ZBM1、ZBM2聚为一组,ZBM6和ZBM9聚为一组,ZBM1、ZBM2的复合香气特征中以突出的柑橘香,甜香,区别于其他花椒;ZBM3-ZBM9乙酸松油酯含量高于ZBM1和ZBM2,木香、花香和膏香较为突出;其中ZBM6和ZBM9的芳樟醇含量高于另外5种花椒,仅次于ZBM1和ZBM2,说明这两种花椒除了具有较为突出的木香和花香,柑橘香和甜香味也比较浓郁,这与GC-MS分析结果基本一致。主成分分析也进一步证实,芳樟醇、反式-4-侧柏醇、(1R,3R,4R,5S)-1-异丙基-4-甲基双环[3.1.0]己烷-3-乙酸乙酯、乙酸松油酯、大根香叶烯香气贡献相对较大,特别是芳樟醇、反式-4-侧柏醇、乙酸松油酯,其相对含量在九种花椒中有较大差异,这些挥发性物质能够用于区分这9种花椒。本研究中9种花椒具有由多种挥发性香气物质形成的复合香气特征,这些具有不同香味的挥发性香气物质共同构成了花椒的主体香气,同时一些含量差异明显且香味特征突出的成分还可能是区分不同产地花椒的关键化合物,为区分不同品种花椒奠定基础。