PGPR菌剂对攀西高原植烟土壤nifH基因群落的影响

李思思 陈玉蓝， 王 勇 秦磊涛 陈 强 辜运富，

（1四川农业大学资源学院，四川 成都 611130；2四川省烟草公司凉山州公司，四川 西昌 615050）

氮是植物生长发育的必需营养元素，增施氮肥是农业上常见的提高作物产量与品质的方法，但其利用效率较低，仅为30%～50%左右，氮肥损失严重，未被利用的氮肥主要通过地表径流向下渗透及向上挥发等造成水体污染、富营养化以及温室效应等环境问题［1］。近年来有大量关于解决氮肥利用效率等问题的研究，如从改变肥料种类、不同的轮作制度、调整灌溉等方式以及固氮微生物等角度探索提高氮的利用效率［2-3］。

农业管理措施中，合理施肥能够增加土壤微生物含量，提高土壤微生物多样性［4］。土壤固氮微生物是农业生产中氮素的主要来源之一，能通过固氮酶实现生物固氮。编码固氮酶的基因有nifH、nifK和nifD，其中nifH最为保守［5］。nifH基因是固氮菌发挥固氮作用的必要保证，适量施肥能提高土壤固氮微生物nifH基因的丰度以及固氮微生物的多样性，从而改变土壤环境，加速土壤养分释放，为植物生长提供有利环境［6］。微生物菌剂可提高土壤养分含量及其利用率、加快土壤团粒结构的形成，同时改善土壤细菌群落结构及优势菌多样性，进而为微生物活动创造适宜的微生态环境［7-9］。

凉山地区光热资源充足，是我国优质烟叶生长适宜区之一。氮是烤烟健康生长的一种重要元素［10］。近年来，伴随化肥过量施用，传统优势烟区的植烟土壤出现明显土壤酸化、板结、微生物数量下降、病虫害增加等一系列问题，限制了烤烟正常生产［11］，而增施微生物肥料以提高土壤养分有效性对烟区化肥减施增效具有重要意义。鉴于此，本研究以四川凉山州会理市的植烟土壤为研究对象，研究了不同植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）菌剂对植烟土壤理化性质、固氮酶活性以及nifH基因多样性与群落组成的影响，以期深入认识PGPR 菌剂处理下的植烟土壤氮素固定机制，为在烤烟种植上合理施用氮肥、减少化肥投入、提高土壤质量并最终实现植烟土壤环境的可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本试验于2020—2021 年度在四川省凉山州会理市龙河村植烟示范点（26°64'61''N，102°36'93''E）进行，试验连续进行两年。该地区属亚热带湿润季风气候，年平均气温17 ℃，年均降水量1 000 mm 左右，干湿季节明显，雨热同季，光照充足，是烟叶种植区划中烤烟生态最适宜区。试验地土壤为渗育紫泥田土属，成土母质为紫色页岩风化残坡积物，酸紫泥田土种。土壤基础养分为：pH 值5.12，有机碳5.24 g·kg-1，全氮1.58 g·kg-1，碱解氮68.60 mg·kg-1，有效磷26.60 mg·kg-1，速效钾322.62 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验设5个处理，每个处理3次重复。常规施肥基肥中复合肥用量为600 kg·hm-2。具体处理为：无肥处理（C1）；常规施肥（农家肥7 500 kg·hm-2+复合肥600 kg·hm-2，C2）；PGPR 细菌+农家肥7 500 kg·hm-2+复合肥 600 kg·hm-2（C3）；PGPR 放线菌+农家肥7 500 kg·hm-2+复合肥600 kg·hm-2（C4）；PGPR 真菌+农家肥7 500 kg·hm-2+复合肥600 kg·hm-2（C5）。试验所用农家肥及复合肥均由凉山州烟草公司提供。农家肥养分含量为：有机质含量≥42%，氮+磷+钾≥6%，pH值5.7～8.3。复合肥中N、P2O5、K2O 质量分数分别为12%、12%、25%。移栽后30 d 各处理均追施复合肥225 kg·hm-2。

各处理采用田间随机区组排列，每个处理设置3个烟草种植小区，单个小区面积为5 m×6 m，做3次重复，每小区种植烟苗30株。

PGPR菌剂由四川农业大学微生物学实验室提供，细菌为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.）SCAU1，放线菌为暗色产色链霉菌（Streptomyces Phaeochromogenes）SICAU417，真菌为黑曲霉（Aspergillus niger）SICU-33，三个菌株均已提交中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCM2016106、CCTCCM2018661 和CCTCCM2019778。细菌用LB 液体培养基、放线菌用高氏一号液体培养基、真菌用马铃薯葡萄糖液体培养基于28 ℃培养5 d，然后用无菌蒸馏水稀释成含活菌数约为1×107CFU·mL-1的菌液进行烟苗灌根处理，每小区用量1 500 mL，每株用量约50 mL。

烤烟品种为云烟87（Nicotiana tabacumL.），于每年4月下旬施基肥、起垄、覆膜及烤烟移栽。相关的田间管理均按当地生产规范进行。

1.3 土壤样品采集

于烟株生长旺盛期，采用五点取样法对根际0～20 cm 土层土壤进行采集，混合后土样采集总量不少于0.5 kg，每个处理取3 个平行样品，每个样品去除石砾和杂质落叶后装袋密封，并储存于有冰袋的保温箱中，运回实验室，一部分用于高通量测序的样品于-80 ℃保存，其他土样风干后磨碎过2 mm 筛，用于土壤理化性质分析。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 土壤理化性质测定 采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定采集土壤的速效磷含量，土壤pH值用玻璃电极法测定，土水比为1∶2.5，有机碳含量采用重铬酸钾容量法测定，速效钾含量采用火焰光度计法测定，全氮和碱解氮含量分别采用凯氏定氮法和扩散吸收法进行测定，具体操作方法参考《土壤农化分析》［12］。

1.4.2 土壤固氮酶活性测定 土壤固氮酶活性利用乙炔还原法进行测定［13］，将10 g土壤样品置于50 mL血清瓶中，瓶口密封，抽取瓶内10%的气体再补充注入等体积的乙炔，在28 ℃恒温条件下摇床避光培养2 d。培养结束后，抽取少量瓶内气体用气相色谱法检测乙烯含量，以不加土壤、注入乙炔的血清瓶作为对照，3次重复。

1.4.3 土壤总DNA 提取及nifH基因扩增子测序 称取0.5 g 土壤样品，采用Fast DNA SPIN Kit For Soil试剂盒（MP Biomedical 公司，美国），按照说明书上的步骤提取土壤微生物总DNA，1% 琼脂糖凝胶电泳检测，-20 ℃保存。使用特异性引物nifH-F（5'-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3'）与nifH-R（5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGC-CATCAT-3'）对nifH基因片段进行扩增［14］。扩增体系20 μL：PCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，10 ng·μL-1DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。反应程序为：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环。以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，样品送上海派森诺生物科技股份有限公司用Illumina MiSeq平台进行测序。

1.5 数据分析

土壤理化性质及nifH基因群落多样性指数等基础数据的处理和绘图利用Excel 2013 进行，单因素方差分析利用SPSS 21.0 软件完成。利用CANOCO 5.0 软件对土壤环境参数和nifH基因群落相关性进行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 结果与分析

2.1 不同PGPR菌剂对植烟土壤理化性质的影响

由表1 可知，与C1 和C2 相比，不同菌剂处理显著降低了植烟土壤的pH 值，5 种不同施肥处理下，以不施肥处理（C1）的pH 值最高，C5 处理最低，较C1 降低了10.84%。施用PGPR 菌剂可提升土壤有机碳含量，其中C4 处理最高，较C1 提高了47.39%，不施肥处理（C1）和常规施肥处理（C2）的土壤有机碳含量较低。施用PGPR 菌剂同样有利于提高植烟土壤全氮含量，其中以C4 处理的全氮含量最高，较C1 提高了11.11%，C2 处理最低。菌剂处理同样提高了土壤有效磷含量，其中以C4 处理的土壤有效磷含量最高，较C1提高了15.56%。C5处理可以显著提高土壤速效钾含量，较C1提高了13.54%。上述结果表明PGPR菌剂对土壤理化性质有明显影响，可以改善烤烟根际微环境。

2.2 固氮酶活性与土壤理化性质的相关性分析

由表1 可知，固氮酶活性的变化范围为0.83～1.04 nmol·g-1·h-1，不同PGPR 菌剂处理能显著提高植烟土壤固氮酶活性。由表2 可知，固氮酶活性与土壤pH值呈极显著负相关（R=-0.642，P＜0.01）。

表2 土壤固氮酶活性与理化性质的皮尔逊相关性分析Table 2 Pearson correlation analysis between nitrogenase activity and physical and chemical properties

2.3 PGPR菌剂对植烟土壤nifH基因群落的影响

2.3.1 PGPR 菌剂对植烟土壤nifH基因群落多样性指数的影响 对不同PGPR 菌剂处理下的土样nifH基因进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）的聚类后，其在OTU 数量上的差异见图1。结果显示，不同PGPR 菌剂处理会对植烟土壤nifH基因群落数量产生明显影响。5 个土样的共有OTU 数目是311，而特有OTU数量差异明显，介于45～473之间。以C3 处理下的土壤特异OTU 数量最多，为473；C2 处理最少，仅有45。

图1 不同PGPR菌剂处理下植烟土壤nifH基因群落的Venn花瓣分析图Fig.1 Venn analysis of the nifH gene community composition of the tobacco cultivation soil inoculated with different PGPR strains

不同PGPR 菌剂处理下植烟土壤nifH基因群落多样性如表3 所示，其中C3 处理（即PGPR 细菌+化肥常规施用）Shannon 和Simpson 指数最高，表明PGPR 细菌+化肥常规施用处理可提高植烟土壤nifH基因群落多样性。

表3 不同PGPR菌剂处理下土壤nifH基因的多样性指数Table 3 Diversity indexes of the nifH gene communities under different PGPR inoculum

2.3.2 PGPR 菌剂对土壤nifH基因群落组成的影响不同菌剂处理下的土壤nifH基因群落组成见图2。结果显示，在门水平上，土壤优势菌群是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和蓝菌门（Cyanobacteria）。变形菌门（Proteobacteria）在C1、C2、C3、C4、C5 处理中的相对丰度分别为93.9%、85.0%、83.7%、96.1%、90.4%，均为优势菌门。而厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度在C3处理最高，为9.2%，蓝菌门（Cyanobacteria）相对丰度在C2处理中最高，为6.9%。

图2 不同PGPR菌剂处理下植烟土壤nifH基因群落在门（A）和属（B）水平上的组成Fig.2 Community composition of the nifH gene at the phylum （A） and genus level （B） in the tobacco cultivation soil inoculated with different PGPR inoculum

在属水平，基于排名前10 的统计数据可以看出，5种处理下的群落组成和丰度在属水平上存在差异。未标明分类物种的占总体14.10%～38.50%，说明该土壤中有仍待挖掘的固氮菌资源。土壤优势菌属为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、地杆菌属（Geobacter）和固氮螺菌属（Azospirillum）。慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）在C1、C2、C3、C4和C5等5个处理中为优势菌属，相对丰度分别为39.6%、30.7%、21.4%、46.4%和55.6%，其中C5 处理最高，C3 处理最低。而地杆菌属（Geobacter）在C1 和C3 处理中相对丰度较高，分别为15.9%、12.7%。固氮螺菌属（Azospirillum）、地杆菌属（Geobacter）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）均归属于变形菌门（Proteobacteria）。在C2、C3、C4、C5 四种施肥处理下的土壤中，变形菌门的慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）是第一优势属。

2.3.3 PGPR 菌剂对植烟土壤含nifH基因优势物种的影响 为了揭示不同PGPR 菌剂对植烟土壤含nifH基因优势物种的影响，本研究进一步统计了不同PGPR 菌剂处理下植烟土壤含nifH基因细菌前20 优势物种相对丰度值的变化，结果见图3。

图3 PGPR菌剂对植烟土壤nifH基因在属水平上前20优势物种相对丰度值的影响Fig.3 Variation of the relative abundance of the top 20 nifH gene at the genus level in the tobacco cultivation soil inoculated with different PGPR inoculum

由图3 可知，相对于两个对照处理（C1 和C2），不同PGPR 菌剂对植烟土壤属水平上的nifH基因群落产生明显影响。C3（细菌PGPR）处理下，中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、固氮菌属（Azotobacter）、类伯克霍尔德氏菌属（Paraburkholderia）、磁螺菌属（Magnetospirillum）和梭菌属（Clostridium）等属的含nifH基因细菌优势物种相对丰度值显著增加（P＜0.05）。而在C4（放线菌PGPR）处理下固氮螺菌属（Azospirillum）、科萨克氏菌属（Kosakonia）和伯克氏菌属（Burkholderia）相对丰度显著增加（P＜0.05）。C5（真菌PGPR）处理下的优势菌属为慢生根瘤菌属（Bardyrhizobium）。

2.3.4 不同施肥处理下植烟土壤nifH基因群落结构与土壤肥力间的关系 本研究以土壤有机碳（soil organic carbon，SOC）、全氮（total nitrogen，TN）、碱解氮（available nitrogen，AN）、有效磷（available phosphorus，AP）、速效钾（available potassium，AK）、pH 值来表征各处理的土壤理化性质改变情况。对不同施肥处理土壤中nifH基因的群落与土壤理化性质进行冗余分析（RDA），结果表明（图4），两轴解释量共达到41.92%。C2 处理的土壤nifH基因群落结构与碱解氮含量呈负相关；在第四象限中，C3 处理的土壤nifH基因群落结构与有效磷、有机碳含量、pH 值呈正相关；C5 处理的土壤nifH基因群落结构则相反，与有效磷、有机碳含量、pH 值等呈负相关，从箭头的连线长度可以看出影响土壤nifH基因群落结构的重要环境因子依次为pH 值＞碱解氮＞速效钾＞有效磷＞全氮＞土壤有机碳。

图4 不同菌剂处理下土壤nifH基因群落与土壤理化性质的冗余分析Fig.4 RDA analysis between nifH gene community composition and physical-chemical properties of soil treated with different PGPR inoculum

3 讨论

近年来，PGPR 菌株在大田条件下对植烟土壤中微生物群落结构和多样性的影响及其机制备受关注［15］，而对植烟土壤功能基因群落结构影响的报道较少。本研究分析了PGPR 菌剂在田间条件下对植烟土壤理化性质和土壤固氮酶活性的影响，并以nifH基因为标记基因，分析了不同PGPR 菌剂对植烟土壤固氮微生物群落结构及多样性的影响。

3.1 不同PGPR菌剂对植烟土壤理化性质的影响

研究表明，接种PGPR 菌剂能有效提高土壤养分的有效性、促进植物对养分的吸收利用［16-17］。Chauhan等［18］将分离出的解硫胺素细菌（Aneurinibacillusaneurinilyticu）CKMV1 接种于番茄种子上，种子萌发率、植株地上部和地下部的干鲜重显著提高。王豹祥等［19］研究表明，接种PGPR 菌肥能够改变烤烟根际微生物数量，提高烤烟根际微生物生物量碳含量，显著提高现蕾期烤烟根际解磷菌数量。Gómez-Godínez 等［20］认为PGPR 菌剂具有固氮酶活性，可显著促进玉米苗的生长。与前人研究相似，本研究同样发现，在植烟土壤上接种具有PGPR 功能的细菌、放线菌和真菌菌剂可以有效提高植烟土壤养分含量、降低pH值。分析原因有二：一是PGPR 菌剂可以分泌生长素（indoleacetic acid，IAA）等植物激素，提高土壤酶活性，从而提高植烟土壤养分含量，促进烤烟生长［21］；二是土壤微生物在分解有机物时产生的有机酸和呼吸作用产生的二氧化碳溶于水形成碳酸，使得土壤pH值降低［22］。

3.2 不同PGPR 菌剂对植烟土壤nifH 基因群落多样性指数的影响

土壤微生物在维护和提升生态系统可持续发展方面具有潜在功能［23］。Wang等［24］研究表明，接种真菌型PGPR菌剂比细菌PGPR菌剂更能够提高土壤微生物的Shannon 多样性指数。另外，PGPR 菌剂配施有机肥可以有效提高玉米种植土中的固氮菌、溶磷菌数量［25］。有关农业管理措施下nifH基因群落多样性的响应变化已有不少报道。前人研究发现，nifH基因群落的改变与土壤有机碳密切相关，且变形菌门是固氮微生物的优势菌门［26-27］。虽然PGPR菌剂被证明能提升土壤肥力、促进烤烟生长，但关于PGPR菌剂对nifH基因群落多样性和组成影响的报道较少，本试验中，施用细菌型PGPR菌剂能提高植烟土壤nifH基因群落多样性，其具体机制有待进一步深入研究。

3.3 不同PGPR 菌剂对土壤nifH 基因群落组成的影响

接种PGPR 菌剂可以改变土壤微生物群落组成。Yang 等［28］研究发现，接种PGPR 菌剂下土壤放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）相对丰度的变化与玉米各时期的生长情况显著相关。目前有研究显示施肥是影响土壤中nifH基因群落组成的重要因素［29］。本研究同样发现，不同PGPR 菌剂对植烟土壤中nifH基因群落组成产生影响，不同PGPR 菌剂处理下植烟土壤优势nifH基因群落明显不同。其中Bradyrhizobium、Geobacter和Azospirillum等含nifH基因微生物是不同PGPR 菌剂处理下的响应标记物种，受PGPR 菌剂影响。Bradyrhizobium是土壤中常见含nifH基因细菌，受氮素肥料影响明显，也会对土壤pH值产生明显影响［30］。

3.4 不同施肥处理下植烟土壤nifH 基因群落结构与土壤肥力间的关系

土壤微生物群落结构与土壤理化性质密切相关［19］。土壤含nifH基因细菌受土壤有机碳含量和pH值影响显著，从而影响固氮微生物群落分布和土壤固氮酶活性［26］。本研究结果表明，土壤pH 值、碱解氮和速效钾含量是影响植烟土壤nifH基因群落组成及多样性的重要环境因子。土壤pH 值是影响土壤微生物多样性和群落组成的重要因子［31］，本研究结果显示，PGPR 菌剂的施用降低了土壤pH 值，从而导致nifH基因群落结构的改变。土壤碱解氮含量也是影响nifH基因群落结构的重要环境因子，与前人研究结果一致［32］。关于土壤速效钾含量与nifH基因群落结构间的相互关系，前人鲜有报道，但Zhao 等［33］在有关盐碱土中微生物与土壤理化性质间的关系研究中发现，土壤速效钾含量是影响土壤细菌群落组成的重要因子，可能是盐碱土中的Na+含量较高，K+有利于平衡Na+对土壤微生物的毒害。本研究发现，植烟土壤速效钾含量是影响nifH基因群落结构的重要环境因子，可能是由于烤烟是一种喜钾植物，在生长过程中需要大量的钾肥，从而影响了植烟土壤中nifH基因群落的结构。

4 结论

PGPR菌剂对攀西高原植烟土壤理化性质、固氮微生物群落组成及多样性产生明显影响，细菌型PGPR显著提高了土壤nifH基因群落的相对丰度值（P＜0.05），变形菌门（Proteobacteria）的慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、地杆菌属（Geobacter）和固氮螺菌属（Azospirillum）为植烟土壤的优势属，土壤pH 值、碱解氮和速效钾含量是影响土壤nifH基因群落组成的关键因子。