金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

龙凌云 黄秋岚 黄秋伟 檀小辉 李慧敏 刘功德 单 彬 毛立彦

（广西壮族自治区亚热带作物研究所/农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室/广西亚热带特色水果质量安全控制重点实验室，广西 南宁 530001）

蔗糖是植物维持正常生命活动必需的碳水化合物，在平衡植株内“库-源-流”关系［1-2］、调节转运蛋白和酶活性，参与信号转导、调控组织分化和发育等过程中发挥着重要作用［3-6］。植物的蔗糖生物合成是由蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖形成蔗糖-6-磷酸，再由磷酸蔗糖磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase，SPP）进一步水解蔗糖-6-磷酸形成蔗糖，其中SPP 催化蔗糖生物合成的酶反应是不可逆的［7］。早期研究认为植物SPS 是蔗糖生物合成途径的关键酶，SPP 并非主要调节点［2］。Chen 等［8］对烟草SPP基因进行RNA干扰沉默表达，发现转基因植株中随SPP表达量的大幅度降低，蔗糖和六碳糖含量同步大幅度下降，淀粉含量则高出正常植株3～5 倍，表明SPP基因可影响光合碳在不同储能物质间的分配。Maloney 等［9］借助酵母双杂和双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）发现拟南芥（Arabidopsis thaliana）的SPS 和SPP 蛋白存在互作关系，可形成二聚体复合物，将35SP：SPP-SPS-YFP 载体转化入拟南芥和杨树进行表达，发现过量表达SPP-SPS 融合体可使蔗糖等可溶性糖含量升高和淀粉含量下降，促进植株生长。上述研究表明，SPP 也可作为关键酶调控蔗糖生物合成过程，影响植物生长和发育。

现已从拟南芥（A.thaliana）［10］、水稻（Oryza sativa）［11］、玉米（Zea mays）［3］、小麦（Triticum aestivum）［12-13］等植物中鉴定出众多SPP基因。这些植物SPP蛋白与HAD超家族成员在含有催化酶活性位点的保守基序上存在同源性，其磷酸酶/水解酶催化活性位点位于N 末端的S6PP 结构域，而C 末端存在1 个不具催化作用的S6PP_C 结构域［3，11，14］，单子叶与双子叶植物SPP 蛋白均含有S6PP 和S6PP_C 结构域，但两者进化趋势差别明显，结构域部分序列的突变可能使单子叶和双子叶植物SPP 蛋白在酶活力、稳定性等功能上产生微小变化［15］。因此，酶基因及其编码蛋白的结构是决定其活性功能和催化效率的决定因素之一［16］，探究植物SPP基因及其编码蛋白的结构差异和进化演变规律，对开展SPP的基因工程研究具有重要意义。

金柑（Fortunella crassifioliaSwingle）是可带皮食用的蔗糖积累型柑橘类水果［17-19］，果实内可溶性糖积累以蔗糖为主，蔗糖含量高低很大程度上影响了金柑果实的甜味品质［20-22］。为进一步研究金柑蔗糖生物合成分子机理，本研究基于广西壮族自治区亚热带作物研究所广西名特优农产品加工研究团队（本课题组）前期获得的四倍体品种脆蜜金柑（F.crassifioliaSwingle cv.Cuimi）果肉转录组测序数据，克隆得到金柑的1 个SPP基因，并对其进行原核表达和组织特异表达，及编码蛋白结构和功能预测等分析，以期为后续金柑分子植物育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为广西壮族自治区亚热带作物研究所（北纬22°90'，东经180°34'）收集保存的四倍体金柑品种脆蜜金柑，2019 年种植于广西亚热带特色水果质量安全控制重点实验室试验大棚（北纬22°90'53″，东经180°34'18″），植株为嫁接苗，砧木为枳壳。脆蜜金柑是从二倍体滑皮金柑（F.crassifioliaSwingle cv.Huapi）的芽变单株选育而成的高糖新品种，花期为6 月上旬至7 月上旬，果实成熟期在11 月下旬至12 月中旬，全年开花2～3 批次［23］。根据脆蜜金柑果实物候期，本试验样品采集于2022 年6 月至12 月，选择第一批次花的果实作为试验对象，并对结果枝绑定标签牌记录开花时间，分别按花开放后15 d（初果期，DAF15）、60 d（生长期，DAF60）、120 d（膨大期，DAF120）和180 d（成熟期，DAF180）采集样品，第二批和第三批次花进行人工摘除。按标签牌所记录开花时间，从果树东、南、西、北4 个方向采集无病虫害、无机械损伤的新鲜果实，每个时期采集20个果实，均分为4份，随后将果实样品放入自封袋，每个时期均按1～4 号进行编号，其中1～3 号样品用于转录组测序和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），4 号样品用于基因克隆。在广西亚热带特色水果质量安全控制重点实验室进行样品前处理，除15 d（DAF15）采摘时期的样品果实较小，无法分离果肉和果皮外，其他时期样品均去除果皮、种子保留果肉组织，按对应编号将样品进行液氮速冻和研磨，分装到10 mL 离心管并编号，-80 ℃超低温冰箱保存，用于后续基因的克隆和表达分析。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA 提取和cDNA 第一链合成 参照RNAiso plus RNA 提取试剂盒（大连TaKaRa 生物技术有限公司）说明书提取金柑果肉样品总RNA。提取的RNA 用ND5000 超微量紫外可见分光光度仪（北京百泰克生物技术有限公司）上，测定260和280 nm的吸收值，确保抽提样品的OD260/OD280在1.8～2.0 范围，并用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性和DNA 污染情况，确保条带清晰。随后将符合质量的RNA 进行反转录，以提取的总RNA 为模板，按HiScriptⅢ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）反转录试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）说明书合成cDNA第一链，于-40 ℃保存备用。

1.2.2 金柑FcSPP基因cDNA 全长克隆 根据本课题组前期脆蜜金柑果肉转录组数据筛选的Unigene（ID：sjg218640），经开放阅读框（open reading frame，ORF）预测分析并设计ORF 序列引物FcSPP-5CDS 和FcSPP-3CDS（如表1 所示），经PCR 的扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物切胶回收后，参照pMDTM19-T Vector Cloning Kit 克隆载体试剂盒（TaKaRa 生物技术有限公司，大连）说明书连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆并进行测序检测，测序结果与筛选的Unigene进行序列比对，确认扩增序列为FcSPP基因编码序列（coding sequence，CDS），重组质粒命名为pMD19T-FcSPP。根据扩增获得的CDS，按Vazyme HiScript-TS 5'/3' RACE Kit RACE 试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）说明书的反应体系和程序，分别合成5'/3'RACE-Ready cDNA。然后设计RACE 扩增的5'-RACE 引物FcSPP-5GSP1 和3'-RACE 引物FcSPP-3GSP1（如表1 所示），分别将获得的5'/3'RACE-Ready cDNA 产物经Dilution Buffer 以1∶1 体积进行稀释并作为模板，按RACE 试剂盒操作流程进行第一轮扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并根据试验结果参照RACE 试剂盒中可选的巢式PCR（nested PCR）流程，设计巢式PCR 引物，即5'-RACE 引物FcSPP-5GSP2 和3'-RACE 引物FcSPP-3GSP2（如表1 所示）。将第一次RACE扩增产物按1∶49 ddH2O稀释后作为模板，分别扩增5'/3'RACE 产物，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 试验中所用FcSPP基因的引物序列、名称及用途Table 1 Olionucleotide primer names，sequences and function in the amplification of FcSPP genes

切胶回收产物，参照pMDTM19-T Vector Cloning Kit 克隆载体试剂盒（TaKaRa 生物技术有限公司，大连）说明书，将回收产物分别连接到pMD19-T 载体上，随后进行大肠杆菌感受态细胞转化，在抗性平板上挑选阳性克隆送南京集思慧远生物科技有限公司测序。

利用DNAMAN 8.0 软件将上述PCR 扩增获得的FcSPP基因CDS，以及5'末端和3'末端cDNA 序列进行拼接获得的FcSPP基因cDNA 全长序列，在NCBI 数据库中的ORF Finder 功能查找ORF，并在基因两端UTR区域设计引物FcSPP-5UTR 和FcSPP-3UTR（如表1所示），以总RNA 的反转录cDNA 为模板，参照PCR 扩增试剂盒（TransTaq®High Fidelity （HiFi） PCR SuperMix，北京全式金生物技术有限公司）说明书的反应体系和程序进行扩增。扩增产物切胶回收后送南京集思慧远生物科技有限公司测序，测序结果进行ORF 分析，并将拼接的目的基因全长序列与扩增测序序列进行比对，确定所拼接的序列是否为目的基因cDNA序列。

1.2.3FcSPP基因及编码蛋白的生物信息学分析 利用在线分析工具Translate（https：//web.expasy.org/translate/）将FcSPP基因CDS翻译成蛋白序列；ProParam（https：//web.expasy.org/protparam/）进行蛋白理化性质预测。SignalP 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）预测蛋白信号肽；NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）预测蛋白磷酸化位点；SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）预测蛋白二级结构；Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）在线软件分析蛋白结构域；借助在线软件CD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和本地软件CLUSTAL X 2.1、GeneDOC 2.7 对FcSPP 蛋白序列进行保守序列分析，并将其与拟南芥、水稻、玉米等物种的SPP蛋白序列进行比对，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）在MEGA11绘制系统进化树。

1.2.4FcSPP基因的原核表达 以获得的重组质粒pMD19T-FcSPP为模板，在FcSPP基因CDS 的FcSPP-5CDS 和FcSPP-3CDS 上添加NdeⅠ（CATATG）和XbaⅠ（TCTAGA）酶切位点，进行PCR 获得扩增产物。经电泳检测回收扩增产物，经T4DNA 连接酶连接到空pCZN1 载体，连接产物经16 ℃过夜培养转化到Arctic Express（DE3）感受态细胞，在含有氨苄青霉素（Amp）的平板培养基上进行抗性筛选，菌液PCR 扩增筛选阳性克隆，并送公司测序鉴定，鉴定正确的表达载体重命名为pCZN1-FcSPP。

挑取转化平板上测序正确的阳性克隆菌株接种到TB 培养液（含50 mg·L-1Amp），37 ℃、220 r·min-1条件下振荡培养过夜；次日按1∶100 比例转接于含Amp 的TB培养液，37 ℃、220 r·min-1振荡培养过夜；待OD600值在0.6～0.8时，吸取1 mL培养液经离心、弃上清后，加入100 μL上样缓冲液重悬菌体沉淀，备用；剩余培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG）并调整浓度至0.2 mmol·L-1，15 ℃、220 r·min-1振荡培养过夜，诱导融合蛋白表达，次日吸取1 mL培养液，经离心、弃上清后，加入100 μL上样缓冲液重悬菌体沉淀，备用；剩余培养液经离心、弃上清，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）重悬菌体沉淀，重悬液随后经超声波破碎，分别吸取取上清液和沉淀液体加入上样缓冲液重悬。采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对上述重悬液进行电泳检测，考马斯亮蓝染色显带。

1.2.5 FcSPP 蛋白的制备和纯化 将最适IPTG 浓度和温度条件下诱导表达后的培养菌液，经低温离心后，收集菌体沉淀加入裂解液重悬，重悬液经超声破碎、离心，收集沉淀。使用包涵体洗涤液清洗包涵体3 次，并用溶解缓冲液按一定比例溶解包涵体，4 ℃放置过夜。利用低压层析系统，将包涵体溶液以0.5 mL·min-1流速上样至Ni-IDA-Sepharose Cl-6B 亲和层析柱，并用Ni-IDA 缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。将洗脱液装入透析袋，4 ℃环境下经PBS 溶液透析过夜，获得FcSPP 纯化蛋白。采用12% SDS-PAGE 对上述纯化蛋白进行电泳检测，考马斯亮蓝染色显带检测纯度，并采用0.5 mg·mL-1牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）标准品对纯化蛋白进行分子量鉴定。

1.2.6 qRT-PCR检测 每个时期均取1～3号样品作为生物学重复，分别制备总RNA和反转录，以FcSPP基因的CDS序列片段设计定量表达引物FcSPP-F和FcSPPR，参照魏清江等［24］已发表的Actin基因为内参基因设计引物actin-F 和actin-R（表1），经qRT-PCR 检测金柑FcSPP基因在果实发育4 个时期的果肉组织表达情况。qRT-PCR 扩增体系为20μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，FcSPP-F 引物1 μL，FcSPP-R 1 μL，cDNA 模板1 μL，RNase-free ddH2O 7μL；反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 个循环；72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔct方法计算结果，每个时期每个编号样品均重复测试3次。

2 结果与分析

2.1 金柑FcSPP基因的克隆

根据前期脆蜜金柑果肉组织转录组测序结果，经差异表达分析筛选Uingene 序列（ID：sjg218640）并按该Unigene 预测的CDS 序列设计引物，以脆蜜金柑果肉组织提取的总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR 扩增，扩增产物长度约为1 200 bp；扩增条带经测序显示片段长度为1 191 bp（图1-A），与预期结果基本符合。利用5'-RACE 引物扩增获得长度为262 bp 的片段，3'-RACE 引物扩增获得长度为283 bp 的片段（图1-B）。利用DNAMAN 软件拼接上述CDS 扩增片段、5'-RACE 和3'-RACE 扩增片段，获得金柑FcSPP基因cDNA 全长序列1 638 bp（图2）。根据拼接的cDNA 全长序列两端UTR 区设计引物，PCR 扩增获得一条长度为1 537 bp 的片段（图1-C 和图2）。将获得的片段测序后与拼接的全程序列进行BLAST 比对，结果显示该片段包含基因的ORF 区域，且UTR 区域与拼接序列一致，表明成功获得金柑FcSPP基因cDNA 全长序列，并将其命名为FcSPP。

图1 金柑FcSPP基因的PCR扩增结果Fig.1 Amplification of FcSPP from Fortunella crassifiolia Swingle

图2 RACE扩增产物拼接的金柑FcSPP基因cDNA全长序列Fig.2 Full-length cDNA sequence of FcSPP gene in Fortunella crassifiolia Swingle

2.2 金柑FcSPP 基因及编码蛋白序列的生物信息学分析

经NCBI的ORF Finder分析后，发现克隆基因含有一个1 191 bp 的ORF，编码396 个氨基酸（图3）。通过ProParam 在线预测该基因编码蛋白的理化性质可知，FcSPP 蛋白分子质量为44 519.93，理论等电点（pI）为6.57，包含6 271 个原子，分子式为C1984H3139N543O590S15，如表2 所示该蛋白序列中数量排名前三的氨基酸分别为Leu（9.10%）、Lys（7.80%）、Ser（7.60%），数量最少的为Cys（1.80%）。带负电荷残基（Asp+Glu）53 个，带正电残基（Arg+Lys）51 个，脂肪系数为88.13，不稳定指数为34.70，总平均亲水性值为-0.337，预测蛋白为稳定的亲水性蛋白。亚细胞定位预测该蛋白定位于细胞质内，推测该蛋白在细胞质内发挥作用。磷酸化位点预测结果显示（图3），该蛋白中发现23个潜在的Ser磷酸化位点、10个潜在的Thr磷酸化位点和4个潜在的Tyr 磷酸化位点。二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大，分别占比为38.89%和38.64%（图4-A）。如图4-B、C 所示，信号肽预测显示该蛋白的C-MAX为0.173，Y-MAX 为0.161，S-MAX 为0.321，均小于阈值0.5，且跨膜结构分析显示该蛋白无明显的疏水区域和跨膜结构，推测该蛋白为亲水性蛋白。

图3 金柑FcSPP蛋白的磷酸化位点分析Fig.3 Analysis of phosphorylation sites of FcSPP protein in Fortunella crassifiolia Swingle

图4 FcSPP蛋白亲疏水性、信号肽和二级结构分析Fig.4 Hydrophobicity or hydrophilia，signal peptide and secondary structure analysis of FcSPP protein

保守结构域分析结果如图5-A 所示，金柑FcSPP蛋白含有2 个属于植物SPP 家族特征的保守结构域，从N 端到C 端分别为S6PP（残基9～261）和S6PP_C（残基262～394）。对FcSPP 的保守基序（Motif）分析结果如图5-B 和图6 所示，该蛋白的S6PP 保守结构域内含有3 个与L-2-卤代酸脱卤酶HAD 超家族同源的保守基序，分别为Motif Ⅰ：DLDNTM（残基15～20）、Motif Ⅱ：LVFSTGR（残基48～54）和Motif Ⅲ：KG（23x）GDSGND（残基176～206），其中Motif Ⅰ中D（Asp-15）、L（Leu-16）、D（Asp-17）、H（His-18）和T（Thr-19），Motif Ⅱ的T（Thr-51），Motif Ⅲ的K（Lys-176）、G（Gly-201）、D（Asp-202）、D（Asp-206）均预测与HAD 超家族成员的蛋白催化或活性位点的氨基酸残基同源匹配。

图5 金柑FcSPP的保守结构域（A）与保守基序（B）分析Fig.5 Conserved domains （A） and conserved motif （B） analysis of FcSPP in Fortunella crassifiolia Swingle

图6 金柑与其他高等植物的SPP蛋白序列比较分析Fig.6 Comparative analysis of SPP protein sequences between Fortunella crassifiolia Swingle and other higher plants

从NCBI和UniProt数据库中获得拟南芥（A.thaliana）、水稻（O.sativa）、玉米（Zea mays）、甜橙（Citrus sinensis）等物种的25 个SPP 蛋白序列，并与克隆基因FcSPP编码蛋白进行系统进化树分析，从图7 可知，FcSPP 蛋白与同为芸香科柑橘亚科的甜橙（C.sinensis）、克莱门柚（C.clementina）的进化关系最近，首先聚为一支，与拟南芥、苹果（Malus domestica）、蓖麻（Ricinus communis）、猕猴桃（Actinidia chinensis）等双子叶植物聚为一个大分支，亲缘关系较近，而与玉米、甘蔗（Saccharum officinarum）、水稻、大麦（Hordeum vulgare）等单子叶植物的亲缘关系较远。来源于双子叶植物的SPP蛋白均聚为一大分支，来源于单子叶植物的划分为另一大分支，表明单子叶植物和双子叶植物的SPP 蛋白在进化过程出现了明显的分化。为了进一步探究单子叶植物和双子叶植物SPP 蛋白出现明显进化变异的因素，本研究对供试的26 个SPP 蛋白分别进行了全序列和结构域序列的比对分析。比对结果显示26 个SPP 蛋白的全序列比对平均相似度为72.06%，表明植物SPP 蛋白的氨基酸全长序列较为保守；而S6PP结构域的平均相似度高达82.03%，S6PP_C 保守结构域的平均相似度仅为53.94%，故推测S6PP_C 结构域的稳定性低于S6PP 结构域，该结构域序列上的突变是导致单子叶植物和双子叶植物SPP蛋白的进化趋势出现明显差异的重要因素。

图7 金柑与其他高等植物的SPP蛋白进化树分析Fig.7 Evolutionary tree analysis of SPP proteins in higher plants and Fortunella crassifiolia Swingle

2.3 金柑FcSPP基因的原核表达与蛋白纯化

将重组质粒pCZN1-FcSPP转化至Arctic Express（DE3）感受态细胞中，经菌液PCR 验证和阳性克隆菌株测序验证，筛选成功插入表达载体的阳性重组菌株。以空载pCZN1 质粒的菌株为阴性对照，将阳性重组菌株和阴性对照菌株在最适IPTG 浓度0.2 mmol·L-1和15 ℃温度诱导条件下进行培养，并对菌液和菌株破碎裂解后的上清液与沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。由图8-A可知，阴性对照菌株诱导表达后菌液和未经诱导表达的重组菌株菌液在45 kDa 处均无明显条带，经诱导表达的重组菌株的菌液及其菌株破碎裂解后收集的上清液与沉淀均在45 kDa处有明显蛋白条带，其大小与预期FcSPP 重组蛋白条带大小相符合，且收集的沉淀所显示的条带单一、明显，表明重组蛋白主要以包涵体形式存在。随后对收集的重组蛋白包涵体进行溶解、Ni 亲和层析柱洗脱和PBS 溶液透析纯化，经标准品分子量鉴定显示FcSPP 纯化蛋白的分子量为45.96 kDa（图8-C），与生物信息学预测的分子量相近。

图8 金柑FcSPP蛋白诱导表达与纯化、鉴定Fig.8 Induced expression，purification，and identification of FcSPP protein in Fortunella crassifiolia Swingle

2.4 金柑FcSPP基因的表达分析

用qRT-PCR 检测脆蜜金柑发育4 个时期即初果期（DAF15）、生长期（DAF60）、膨大期（DAF120）和成熟期（DAF180）的果肉组织中FcSPP基因表达量。如图9所示，熔解曲线显示目的基因FcSPP有一个特异峰，表明试验所用引物具有较好的特异性，排除了引物二聚体、非特异性扩增产物对试验结果的影响。定量数据分析结果显示，在脆蜜金柑果实发育4 个时期FcSPP基因相对表达量呈逐步上升趋势，果实膨大期、成熟期的基因表达量显著高于果实发育初期和生长期（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 金柑FcSPP蛋白的结构特征

SPP 是生物体蔗糖生物合成途径的末端酶，具有一个特征性的磷酸水解酶结构域，广泛存在于光合细菌、蓝藻、苔藓、裸子植物和被子植物［25-27］，依据结构域种类可将SPP蛋白分为3种类型，低等植物如蓝藻仅含有具备磷酸水解酶功能的S6PP 结构域（Ⅰ型： S6PP），高等植物含有S6PP 结构域和位于C 末端的S6PP_C 结构域（Ⅱ型： S6PP～S6PP_C），而细菌含有糖基转移酶功能结构域和S6PP 结构域（Ⅲ型：GT～S6PP）［15，28］。本研究基于前期转录组测序数据，从脆蜜金柑果实中成功克隆到1个磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP。生物信息学分析结果显示，该基因编码蛋白存在S6PP和S6PP_C这2个结构域，共含有37个潜在磷酸化位点，表明克隆基因编码蛋白中含有发挥磷酸酶/水解酶催化功能的核心元件，属于高等植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。前人研究表明，大多数被子植物存在多个SPP异构体，且不同异构体编码基因的表达随植株发育、组织类型和环境信号的变化而变化［25］。在拟南芥［10］、水稻［11］、玉米［3］、小麦［12-13］等作物中均鉴定出多个SPP 异构体。本研究中仅克隆了1个磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP，金柑是否还存在其他构型的磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP有待进一步研究。

3.2 金柑FcSPP蛋白S6PP_C结构域序列变化的意义

不同植物物种的细胞内蔗糖代谢水平存在明显差异，造成这种差异可部分归因于SPP、SPS 等参与蔗糖生物合成的关键酶在细胞质内中的活性、稳定性、pH值的变化，而这些变化又由关键酶基因及其编码蛋白的序列变化差异造成的［15］。前人研究认为，植物SPP的S6PP 结构域是由共同的细菌祖先通过基因分裂和融合进化而来，作为催化活性中心的S6PP结构域为维持其催化机制、空间结构折叠稳定的需求，在跨物种间的进化速率较低，而S6PP_C结构域在进化上形成的时间晚于S6PP 结构域，两者的进化压力存在较大差异，S6PP_C 结构域表现出较高的序列变化率［15，29］。本研究中金柑、拟南芥、水稻等17个物种的26个SPP蛋白，在系统进化树中可划分为单子叶植物和双子叶植物两大类，而这两大类SPP 蛋白的S6PP_C 结构域的序列相似度明显低于S6PP结构域，推测单子叶和双子叶植物的SPP蛋白在进化上的进化速率与方向出现分化，主要来自于S6PP_C 结构域序列变化的影响。此外，Tomás等［10］将拟南芥SPP2 （Q9SJ66）蛋白的S6PP_C 结构域去除后，形成的单体酶且活性显著低于完整的SPP2蛋白，并将蓝藻（Synechocystissp.PCC 6803）SPP（仅含有S6PP 结构域）与去除了S6PP_C 结构域的拟南芥SPP2蛋白进行重组融合，经凝胶过滤和BiFC 分析发现S6PP_C 可促进融合蛋白的二聚化。推测植物SPP 蛋白的S6PP_C 结构域可能通过氨基酸残基的变化影响SPP的空间结构，进而影响酶活力变化。

3.3 金柑FcSPP基因在果实发育不同时期的表达变化

拟南芥［10］、水稻［11］、玉米（Z.mays）［3］、小麦（T.aestivum）［12-13］、芒果（Mangifera indicaL.）［30］、辣椒（Capsicum annumm）［31］、橡胶树（Hevea brasiliensis）［32］等植物中已鉴定的SPP基因表达模式研究显示，该基因表达水平在植物不同组织和发育过程中存在明显的变化。此外，前人研究表明植物中的SPP 活性与SPS 活性相似，两者有可能相互结合形成一个多酶复合体，提高蔗糖-6-磷酸的合成速率，在蔗糖合成过程中发挥着重要作用［9-10］。本研究克隆的FcSPP基因，在金柑果实从初果期到成熟期的表达量呈现逐步上升趋势，膨大期和成熟期的表达量显著高于初果期和生长期，推测克隆的FcSPP基因可能参与调控了金柑果实中后期的糖代谢和分配过程，从而影响果实生长发育。但金柑的SPP和SPS基因编码蛋白之间是否可形成复合体或存在互作关系尚需进一步研究。

4 结论

本研究从脆蜜金柑果肉中成功克隆到1 个磷酸蔗糖磷酸酶基因FcSPP，可在异源的大肠杆菌中顺利诱导表达，为后期开展细胞工程制备SPP 蛋白酶提供了可用的目标基因。生物信息学预测了可能影响金柑FcSPP 蛋白催化效率的10 个活性残基位点D（Asp-15）、L（Leu-16）、D（Asp-17）、H（His-18）、T（Thr-19）、T（Thr-51）、K（Lys-176）、G（Gly-201）、D（Asp-202）和D（Asp-206）；系统进化分析表明负责SPP 蛋白二聚化作用的S6PP_C 结构域的碱基突变频率较高，对SPP 蛋白的酶活力变化具有重要影响。故而后期开展金柑FcSPP基因的基因编辑等工程研究中，应重点关注上述活性位点和结构域序列碱基突变区域。