高黎贡山不同海拔棕色绿僵菌对温度的适应性

徐 玲 张翼飞 陈 凯

（1.保山学院高黎贡山研究院；2.云南省教育厅高黎贡山虫生真菌资源保护与绿色发展重点实验室，云南保山 678000)

绿僵菌（MetarhiziumSorokin）是一种具有广谱杀虫能力的虫生真菌，被认为是最具开发潜力的真菌杀虫剂之一，具有重要的生态和经济价值。绿僵菌在实际应用过程中常受环境因素的制约而导致其杀虫效果大大降低，环境条件对绿僵菌的生长具有较大影响，绿僵菌不同菌株要求的环境条件不同[1]。自然界中不同地理生境的环境条件不同，也使绿僵菌种群和数量存在很大差异[2，3]。环境温度是影响绿僵菌生长和地理分布的重要的因素之一[4]，也是利用绿僵菌防治害虫必须考虑的条件之一。

高黎贡山是世界生物圈保护区，也是我国生物多样性保护的关键地区之一，其地理环境复杂多样，生态因子垂直差异较大[5]。棕色绿僵菌（M.brunneum）是高黎贡山绿僵菌的优势物种，不同海拔地区都有分布[6]。本研究拟探讨高黎贡山不同海拔的棕色绿僵菌菌株在不同培养温度下的菌丝生长和产孢能力差异，为探明绿僵菌受生境条件的影响奠定基础，为高黎贡山绿僵菌菌株的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：来自高黎贡山25 个海拔地区（170～3 100 m）的棕色绿僵菌菌株（表1），保存于保山学院高黎贡山研究所真菌资源实验室。

表1 绿僵菌菌丝生长和产孢能力与海拔梯度的相关性

1.2 菌株活化

将保存的各菌株分别接种到PPDA 平板培养基上，于25℃恒温培养3 d，恢复菌种的正常生物学活性。

1.3 培养温度对不同海拔地区菌株生长的影响

各菌株分别用打孔器取直径5 mm的菌块，接入到新的PPDA平板培养基中央，分别置于7种不同梯度温度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）下培养，每次处理进行3次重复。培养15 d后用十字交叉法测定各菌株不同处理的菌落直径（mm）。培养20 d各菌株产孢充分后，刮取每个平板培养基上菌落表面的所有孢子粉，用电子天平称取其重量（mg），各菌株不同处理的孢子粉产量（产粉量）为三次重复的平均值。

1.4 统计分析

将不同海拔梯度的菌株分为低（海拔170～900 m 的8 个菌株）、中（海拔1 000～1 900 m 的9 个菌株）、高（海拔2 000～3 100 m的8个菌株）三组。

用SPASS Statistics 22.0软件对各菌株的菌落直径和产粉量与其生境海拔梯度进行相关性分析，对低、中、高三组海拔菌株的菌落直径和产粉量进行单因素差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 高黎贡山棕色绿僵菌菌丝生长和产孢的适宜温度

棕色绿僵菌各菌株在不同温度（5～35℃）下培养15 d后测定菌落直径（图1）。25～30℃培养时，大多数菌株的菌落直径为最大，说明此温度下菌丝生长较快，是棕色绿僵菌的最适生长温度。在15～35℃培养后菌落直径都有不同程度的增大，说明此温度范围为棕色绿僵菌菌丝生长的适宜温度，但当温度降低到20℃和15℃时或上升到35℃时各菌株的菌丝生长速度都明显降低。当温度降低至5℃和10℃后，培养15 d后菌落直径无明显变化，说明温度过低不利于棕色绿僵菌的菌丝生长。

图1 棕色绿僵菌菌株BUM-500在不同温度下培养形成的菌落

棕色绿僵菌各菌株在不同温度（5～35℃）下培养20 d后测定每个平板所产孢子粉质量。所有菌株均表现为在25℃培养时产粉量最大，30℃和20℃次之，15℃较差，温度过低（5℃和10℃）和过高（35℃）都很少产孢或不产孢。可以看出，棕色绿僵菌产孢的适宜温度范围为15～30℃，最适温度为25℃。

2.2 高黎贡山绿僵菌菌株的菌丝生长和产孢能力与生境海拔的相关性

对不同培养温度（15～35℃）下棕色绿僵菌菌株的菌落直径和产粉量与海拔梯度进行相关性分析（表1），发现在≤25℃的温度下培养时各菌株的菌丝生长和产孢能力与其生境海拔都没有相关性，而培养温度上升至30℃和35℃时，菌株的菌丝生长与生境海拔的相关关系为极显著（P＜0.01），温度为30℃时，各菌株的产孢能力与生境海拔也有显著相关性（P＜0.05）。

2.3 不同海拔绿僵菌菌株的菌丝生长和产粉量差异性

对低、中、高三组海拔梯度下各绿僵菌菌株在不同温度下培养后菌落直径（15～35℃）与产粉量（15～30℃）的差异显著性进行单因素方差分析。结果显示（表2），在15～25℃培养时，低、中、高海拔梯度三组菌株的菌落直径和产粉量差异都不显著（P＞0.05）；在较高温度（30℃和35℃）培养时，三组菌株的菌落直径差异都为极显著（P＜0.01）；在30℃培养时，三组海拔菌株的产粉量差异为显著（P＜0.05）。

2.4 不同培养温度下不同海拔绿僵菌菌株的菌丝生长情况

不同海拔菌株在不同温度下培养菌丝生长速度不同（表3）。从三组菌株菌落直径的平均值来看，在15℃、20℃和25℃培养时，低、中、高三组海拔菌株的菌落直径平均值较接近，结合以上相关性和方差分析结果可以看出，在此温度范围内海拔梯度对绿僵菌菌丝生长的影响较小。在30℃培养时，三组海拔菌株菌落直径差异显著，低海拔菌株最高（64.3 mg），中海拔菌株（55.4 mg）其次，高海拔菌株最低（38.8 mg）。在35℃培养时，低海拔菌株（18.0 mg）与中海拔菌株（17.8 mg）的菌落直径均值显著高于高海拔菌株（8.9 mg）。

表3 不同温度培养后不同海拔来源菌株的菌落直径/mm

低、中、高三组海拔菌株的最适生长温度也存在明显差异（表4）。低中海拔（170～1 900 m）的多数菌株在30℃培养时菌落直径达到最大，有12 个菌株（BUM-170、BUM-300、BUM-400、BUM-500、BUM-600、BUM-700、BUM-900、BUM-1000、BUM-1100、BUM-1200、BUM-1400、BUM-1800）的菌落直径超过了60 mm，其中菌株BUM-300 和BUM-400 的菌落直径超过了70 mm。高海拔（2 000～3 100 m）的多数菌株在25℃下培养菌落直径达到最大，但都小于60 mm。可以看出，中低海拔多数菌株的最适生长温度为30℃，而高海拔多数菌株的最适生长温度为25℃。但也有少数菌株并不遵循此规律，如中海拔菌株BUM-1500、BUM-1900的最适生长温度为25℃（菌落直径分别为51.7 mm 和53.0 mm）；高海拔菌株BUM-2400 和BUM-2500 的最适生长温度为30℃（菌落直径分别达50.6 mm和52.5 mm）。

表4 不同温度培养后不同海拔来源菌株的产粉量/mg.板

2.5 不同培养温度下不同海拔地区绿僵菌菌株的产孢能力

不同温度培养下不同海拔菌株的孢子粉产生能力不同（表4）。在15℃和20℃培养时，各菌株的产孢能力都较低，15℃时的产粉量范围为3.6～13.7 mg/板，20℃时的产粉量范围为17.6～44.7 mg/板；三组海拔梯度菌株的平均产粉量也较接近（15℃时分别为6.4 mg/板、6.8 mg/板、7.9 mg/板，20℃时分别为25.5 mg/板、24.9 mg/板、22.6 mg/板）。

在25℃培养时，不同菌株的孢子粉产生能力差异较大，范围为31.0～217.4 mg/板。三组海拔菌株都存在产粉量很高和很低的菌株，低海拔菌株中产粉量最高的菌株超过200 mg/板，但也有2个菌株产粉量不到40 mg/板；中海拔和高海拔也都有产粉量高于100 mg/板和低于40 mg/板的菌株。根据前面相关性和差异性分析结果来看，组间的差异并不显著，海拔与菌株产粉量的相关性也不显著，但从三组菌株的平均产粉量来看，低海拔菌株最高（113.5 mg/板），其次为中海拔菌株（81.1 mg/板），高海拔菌株最低（68.4 mg/板）；低海拔中也存在较多产粉量较大的菌株，低海拔的8株菌中有4 株菌（BUM-170、BUM-500、BUM-600、BUM-800）的产粉量高于100 mg/板，中海拔的9 株菌中有2 株菌（BUM-1600、BUM-1700）的产粉量高于100 mg/板，高海拔的8 株菌中有1 株菌（BUM-2300）的产粉量高于100 mg/板。

在30℃培养时，三组海拔菌株的产粉量差异为显著，范围为6.2～114.5 mg/板，从平均产粉量来看，低海拔菌株（47.0 mg/板）显著高于中高海拔菌株，中海拔菌株的产粉量（19.0 mg/板）略高于高海拔菌株（14.3 mg/板）；同组菌株的产粉量差异也很大，尤其是低海拔菌株，有的产粉量超过100 mg/板，有的不到15 mg/板，中高海拔菌株间的差异相对较小，产粉量都不到40 mg/板。低海拔有3 株菌（BUM-500、BUM-600、BUM-800）的产粉量高于60 mg/板，而中高海拔菌株的产粉量都低于40 mg/板。

3 讨论

3.1 高黎贡山棕色绿僵菌的生长温度

绿僵菌在适宜的温度下生长速度较快，致病力较强[7]。林华峰等[8]对绿僵菌大孢变种的生物学特性进行研究，认为其最适生长温度为25℃。姚君明等[9]研究认为，绿僵菌菌株LA06 和LD04的最适生长和产孢的温度都为25～30℃。张亚波等[10]对绿僵菌菌株WP08 的生物学特性进行研究，认为其菌丝生长最适温度为25～30℃，产孢最适温为25℃。张丽萍等[11]对一株金龟子绿僵菌的固体发酵条件进行研究，认为其最佳发酵温度为26℃，温度升高为30℃时菌丝生长较快，但产粉量较少。本研究中，棕色绿僵菌菌丝最适生长温度范围为15～35℃，菌丝生长的最适温度为25～30℃；产孢温度范围为15～30℃，低于15℃和高于30℃产粉量都极少，产孢最适温度都为25℃。这与大多数关于绿僵菌生长温度的文献报告一致。但高黎贡山不同海拔菌株的菌丝生长最适温度有差异，低中海拔多数菌株的最适温为30℃，高海拔多数菌株的最适温为25℃。

3.2 高黎贡山不同海拔地区棕色绿僵菌对温度的适应性

不同地理来源虫生真菌的遗传多样性与地理距离的相关性目前尚没有一致的定论[3，12]，但已有不少研究表明，不同地理来源虫生真菌在生物学特性、寄主转化性、化学成分等方面都存在较大差异[13-15]。本课题组前期研究[16]结果表明，环境温度是影响高黎贡山绿僵菌分布的主导因子。本研究进一步发现，高黎贡山不同海拔地区分布的棕色绿僵菌菌株对温度的适应能力不同。

在较低温度（15～25℃）培养时，菌落直径和产粉量都与海拔无相关性，低、中、高海拔梯度三组菌株的菌落直径和产粉量差异也不显著，说明在较低温度下生境海拔对绿僵菌的生长影响不大，只有在较高温度下（30～35℃）培养才呈现出一定影响。在30℃和35℃培养时，三组海拔菌株的菌落直径差异极显著，海拔较低的菌株在高温条件下菌丝生长速度较快；在30℃培养时，三组海拔菌株的产孢能力差异显著，低海拔菌株的产孢能力显著高于中高海拔菌株，低海拔也存在较多产粉量较大的菌株，可以看出低海拔菌株更耐受高温。

综合不同海拔菌株的菌丝生长和产孢情况可以看出，生境海拔较低的菌株对高温的适应能力更强，这应该与低海拔地区环境温度较高有关，绿僵菌在长期适应较高温度的环境过程中，产生较多适应高温条件的菌株，这也说明了不同海拔的环境温度对绿僵菌株的环境适应性发挥着重要作用。秦长生等[17]研究了不同来源金龟子绿僵菌菌株的生物学特性，认为不同菌株的生长速度和产粉量受温度的影响差异极显著。农向群等[18]对不同地理来源白僵菌和绿僵菌对高温的耐受力的研究发现，来自温度较低的高纬度地区的菌株对高温最敏感，来自温度较高的非洲地区的菌株对高温的抵抗力最强。这与本研究结果中不同海拔地区绿僵菌生长受温度的影响趋势一致。

低海拔菌株中，BUM-300 和BUM-400 在30℃培养时菌落直径达到最大（70 mm），但这两个菌株的产粉量并不高；BUM-600 和BUM-800 虽然菌落直径未能达到最大，但其菌丝生长速度也较快（30℃时分别为66.7 mm 和59.5 mm），其产孢能力最高，在25℃时产粉量分别为204.4 mg/板和217.4 mg/板，30℃时产粉量分别为96.5 mg/板和114.5 mg/板。绿僵菌对高温的耐受能力是影响其侵染寄主的一个重要因素[7]。在进行生防菌开发时，选用BUM-600和BUM-800这两个菌株进行菌剂生产将会产生较好的应用效果。