β-羟基丁酸抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制

黄云龙，朱玉峰，石 瑾，刘 蓉，曾 婷，韩良辅

1佛山复星禅诚医院肿瘤中心，广东 佛山 528041；2南方医科大学南方医院，广东 广州510515

近年来，癌症的发病数和死亡数呈逐年递增趋势，其中肺癌的发病数和死亡数均居所有癌症之首［1］。临床上将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，约85%的肺癌都属于非小细胞肺癌，其中肺腺癌的发病率最高，占所有类型肺癌的40%以上［2］。肺腺癌一般采用化疗进行治疗，然而，肺腺癌容易对化疗药产生耐药性，限制了化疗在肺腺癌中的应用［3］。靶向药治疗肺腺癌近年得到较大的发展［4］，但其高昂的价格也限制了使用。目前已有很多临床前研究表明生酮饮食（KD）可以抑制多种癌症，涉及的机制包括调控Warburg 效应、炎症、MMP-9、组蛋白乙酰化、糖酵解，抑制p53突变以及激活AMPK途径［5,6］。有研究报道KD可抑制小鼠肺癌细胞增殖并增强对化疗药物的敏感性，但也有其他学者通过临床研究指出KD并不能改善肺癌患者的预后，其可能原因是肺癌患者对KD治疗方案的依从性差［7-10］。同时，由于KD是一种饮食方式，在不同的肿瘤环境下，KD发挥作用的成分和机制可能不同。因此，探索KD饮食发挥抗肿瘤作用的小分子化合物及其具体作用机制，发现用于治疗肺癌的新药物，有助于解决KD直接用于临床肺癌治疗的局限性。

β-羟基丁酸（BHB）是长时间运动、饥饿或缺乏碳水化合物的情况下，葡萄糖的供应不足以满足身体的能量需求时，在肝脏肿由脂肪酸合成并从肝脏向外周组织输送能量的基本载体。有研究指出KD的摄入能明显提升血液中BHB的浓度［11］。有临床研究表明，KD提高了放疗患者的空腹BHB浓度，也改善了患者身体组分和生活质量［12］。这提示BHB可能是KD发挥抗肿瘤作用的小分子化合物。

GPR109A是一种G蛋白偶联受体，被报导可作为BHB的受体被激活，进一步上调抑癌基因Hopx的表达，发挥抑制结肠癌进展的作用［13,14］。有研究指出，KD或者BHB可通过GPR109A激活巨噬细胞的神经保护亚群发挥了神经保护的作用［15］。这提示BHB 和GPR109A之间密切的联系，但目前BHB与GPR109A在肺癌中的作用还未有报道，因此本研究尝试探究BHB对肺腺癌A549细胞的作用及其调控机制，为BHB的临床应用和肺癌治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞A549，小鼠肺癌细胞LLC，F-12K培养基，LLC 细胞专用培养基（普诺赛）；胎牛血清（Gibco）；BHB（MACKLIN）；EdU 细胞增殖检测试剂盒，CCK-8 试剂盒（碧云天生物）；Transwell 小室，Matrigel基质胶（Corning）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物）；GPR109A一抗、β actin 一抗、HRP标记二抗（Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 本研究选择肺腺癌细胞系A549 和LLC（普诺赛），A549细胞所用培养基为含10%胎牛血清的F-12K培养基，LLC细胞使用专用培养基，培养温度为37 ℃，培养箱气体为95%的空气和5%的CO2。

1.2.2 细胞增殖测定 取处于对数期的A549 细胞或LLC细胞，以2×105/孔接种于6孔板，细胞贴壁后饥饿4 h，分组设置为0、5、10 mmol/L 3组，0 mmol/L组加入PBS，其他两组分别加入5、10 mmol/L 的BHB 处理，36 h后按照试剂说明书进行孵育、固定、通透、洗涤、染色和荧光检测。

1.2.3 细胞活性测定 取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，100 μL/孔加入96孔细胞培养板中，细胞数目为8000/孔。37 ℃培养箱培养3 h使细胞贴壁，然后加入不同浓度（0、5、10 mmol/L）的BHB处理，处理后不同时间点（0、1、2、3 d）取细胞进行后续实验。取10 μL CCK-8溶液加入96孔细胞培养板，在37 ℃培养箱中继续孵育2 h，然后测定波长的吸光度A490nm。

1.2.4 细胞迁移测定 培养板接种细胞前先用marker笔在6孔板背面画横线标记。细胞消化后以5×105/孔种入6孔板，待细胞铺满板底后，用10 μL枪头垂直于孔板建立细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。用PBS清洗干净游离细胞，然后分别加入0、5、10 mmol/L的BHB，拍照记录，然后将培养板放入培养箱培养，36 h时拍照记录细胞迁移情况，计算细胞的迁移距离，计算公式为：细胞迁移距离=0 h划痕宽度-36 h划痕宽度。

1.2.5 细胞侵袭测定 对数期细胞在含有10%FBS的培养基中培养2～3代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理24 h。铺胶：4 ℃溶解基质胶过夜；4 ℃预冷小室、培养板和枪头；在4 ℃用无血清的冷培养基稀释基质胶，加入到小室的上层，铺匀在膜上；立即将铺好的基质胶的细胞小室至于培养板中，37 ℃孵育1 h。细胞用PBS清洗1次，胰酶消化，然后用含5%BSA的无血清培养基中和，1500 r/min离心10 min。用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度。取上述细胞液加入小室，下室加入含有10%FBS的培养基。37 ℃孵育48 h。孵育结束后，小心去除细胞小室，吸掉上层培养液，PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定5 min，0.5%结晶紫染色20 min。PBS洗掉多余染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，室温静置风干，显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算均值。

1.2.6 GEPIA2在线分析 利用GEPIA2在线工具（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）对肺腺癌（LUAD）的数据集进行GPR109A表达差异分析。

1.2.7 RT-PCR 样品用1 mL冰PBS洗1次，加入1 mL Trizol，室温静置20 min。加入0.2 mL氯仿混匀，室温静置5 min，4 ℃，12 000g离心15 min，取上清（约60%体积），加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温静置10 min，4 ℃，12 000g离心10 min，弃上清，加入1 mL75%乙醇，混匀，4 ℃，12 000g离心5 min，弃上清，室温下干燥10 min。加10 μL DEPC水溶解RNA，进行核酸定量，判断RNA纯度，并计算逆转录cDNA时所需RNA体积，在20 μL反应体系中RNA的总量为2 μg。根据说明书，取逆转录好cDNA 2 μL在冰上避光加入事先已经配好的Sybr反应体系中，放入real time PCR 仪，95 ℃30 s 预变性，95 ℃变性5 s，退火30 s，共40个循环，检查融合曲线，再根据Ct值计算GPR109A的相对表达量，以β-actin作为内参（人GPR109A 引物Forward：ATGTTGGCTATG AACCGCCAG，Reverse：GCTGCTGTCCGATTGGA GA；人β-actin 引物Forword：CATGTACGTTGCTAT CCAGGC，Reverse：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；小鼠GPR109A 引物Forward：CTGGAGGTTCGGAG GCATC，Reverse：TCGCCATTTTTGGTCATCATG T；小鼠β-actin 引物Forword：GGCTGTATTCCCCTCC ATCG，Reverse：CCAGTTGGTAACAATGCCAT GT）。

1.2.8 Western blot检测 提取细胞蛋白质，离心后的上清蛋白用BCA法定量后，使每个加样孔道中蛋白量为50 μg。每个蛋白样品加入5×上样缓冲液（4:1，v/v），95～100 ℃煮5 min，离心混匀，上样，进行SDS-PAGE 电泳。卸下分离胶覆上PVDF膜电转。电转后浸于1%TBST溶解的5%脱脂奶粉中室温缓慢摇动封闭1 h；封闭完成将膜置于一定稀释比例的特异性一抗在室温缓慢摇动1 h，放入4 ℃冰箱过夜。室温平衡30 min后用1%TBST洗脱5 min，洗3次。将膜放入HRP标记二抗中室温缓慢摇动孵育1 h，1%TBST 洗脱10 min，洗3次。取ECL试剂盒中的发光底物溶液和增强剂溶液（1×）各0.5 mL，混匀后加入膜上作用1～3 min，于ECL成像系统成像，结果用ImageJ软件进行分析。

1.2.9 细胞转染与筛选 GPR109A的shRNA质粒委托吉玛基因构建。为扩增质粒，将10 μL甘油原菌接种到50 mL加氨苄西林（1∶1000稀释）的LB培养基中。转速240 r/min，温度37 ℃，培养14～16 h。在大肠杆菌DH5a中扩增并使用质粒Midi试剂盒纯化质粒。通过测定280和260 nm处的紫外吸收度来确定浓度和纯度。所有质粒的A260/A280比值均为1.9～2.0。转染前24 h 将750W 细胞置于15 cm 板中，使转染时细胞融合达到70%～90%。准备两个5 mL 无菌试管，标记DNA 和PEI。将50 μg DNA稀释到2 mL PBS中，150 μL PEI原液稀释到2 mL PBS中。一次将稀释的PEI加入稀释的DNA中，然后通过轻轻地上下移液两3次将溶液混合。室温孵育15～30 min，使PEI/DNA复合物形成。轻轻滴加2 mL PEI/DNA复合物至培养皿中的细胞。轻轻搅拌混合，在37 ℃5%CO2培养箱中孵育3～6 h。转染后，除去带有PEI/DNA复合物的旧培养基，每盘加入20 mL新鲜完全培养基。在37 ℃5%CO2的培养箱中孵育1夜。收取细胞用于后续实验。

1.2.10 IC50测定 取状态良好的细胞接种于96孔板，于37 ℃、含5%CO2空气及100%湿度的培养箱中培养24 h。细胞贴壁后分别加入0、5、10、20、40、80 mmol/L的BHB处理。在培养箱中继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育4 h，最后用酶标仪测定450 nm处的吸光度A，用Graphpad Prism 8软件计算IC50。

1.2.11 异种移植实验 选取5～6周龄的裸鼠12只适应性饲养1周后，随机分为3组：Control组、BHB组、sh-GPR109A+BHB组，6只/组，Control组和BHB组在右腋皮下接种A549细胞，sh-GPR109A+BHB组接种敲低GPR109A 的A549 细胞。取LLC 细胞和敲低GPR109A的LLC细胞以同样的分组在免疫系统正常的balb/c小鼠中进行异种移植瘤实验。细胞接种当天为D0，D0开始，BHB组和GPR109A+BHB组小鼠灌胃给予BHB[80 mg/（d·只）]连续21 d，Control组灌胃给予同体积无菌水。分别于第9、12、15、18、21天用游标卡尺测量每个小鼠的肿瘤大小，21 d时处死动物，取皮下肿瘤拍照、称重、测量并计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：体积=（长径×短径2）/2。本研究通过南方医院实验动物伦理委员会审查（批号：IACUC-PROJECT-20220624-002）。

1.3 统计学分析

所有数据采用Graphpad Prism 软件统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BHB抑制A549细胞和LLC细胞的增殖、迁移以及侵袭

经过不同浓度的BHB处理A549细胞后，EdU染色结果显示，与对照组相比，5 mmol/L和10 mmol/L BHB处理能抑制A549细胞的增殖，且10 mmol/L BHB处理的抑制效果更为显著（图1A、B，P<0.001）。CCK-8结果显示，BHB以浓度依赖方式降低A459细胞活性（图1C，P<0.001）。同样的处理在LLC细胞中产生了一致结果（图1D～F，P<0.01）。BHB处理同样抑制了A459细胞和LLC细胞的迁移和侵袭，且高浓度BHB处理对A549细胞的抑制效果更显著（图1G～N，P<0.001）。

2.2 BHB可上调A549细胞和LLC细胞中GPR109A的表达

在GEPIA2 数据库中对肺腺癌的数据集进行GPR109A表达差异分析中发现，GPR109A在肺腺癌病人中的表达显下调（图2A，P<0.01）。利用A549细胞在体外进行验证，结果显示在用不同浓度的BHB处理A549细胞后，细胞中GPR109A的mRNA和蛋白表达水平均随BHB浓度升高而上升（图2B～D，P<0.01）。类似结果也在LLC细胞中得到证实（图2E～G，P<0.01）。

2.3 BHB 部分通过介导GPR109A 抑制A549 细胞和LLC细胞的增殖、迁移和侵袭

PCR和Western blot结果显示，GPR109A表达量明显降低，GPR109A 被成功敲低（图3A、B，P<0.001）。CCK-8 结果显示在敲低GPR109A 后，A549 细胞对BHB的IC50高于对照组（图3C，P<0.05）。跟前述结果一致，在sh-NC转染的A549细胞中，BHB能抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力（图3D～F，sh-NCvssh-NC+BHB，P<0.001）。当在A549细胞中敲低GPR109A后，BHB对A549细胞增殖，迁移和侵袭的能力的抑制作用被减弱（图3D～F，sh-GPR109A#3vssh-GPR109A#3+BHB，P<0.01）。在LLC细胞中重复这些实验也得到相一致的结果（图4A～F，P<0.05）。

图3 BHB对A549细胞的抑制作用是由GPR109A部分介导的Fig.3 Inhibitory effects of BHB on A549 cells are partly mediated by GPR109A.A,B:Transfection efficiency of shRNA evaluated using RT-qPCR and Western blotting.C: Viability of A549 cells with GPR109A knockdown evaluated using CCK-8 assay to determine the IC50 of BHB.D:EdU assay for detecting changes in BHB-induced inhibition of cell proliferation.E:Scratch assay for detecting changes in BHB-induced inhibition of cell migration;F: Transwell assay for detecting changes in BHB-induced inhibition of cell migration.Scale bar:100 μm;*P<0.05,***P<0.001;##P<0.01,###P<0.001.

图4 BHB对LLC细胞的抑制作用是由GPR109A部分介导的Fig.4 GPR109A partly mediates the inhibitory effects of BHB on LLC cells.A,B:Transfection efficiency of shRNA evaluated using RT-qPCR and Western blotting.C:CCK-8 assay for determining viability of LLC cells with GPR109A knockdown to calculate the IC50 of BHB.D: EdU assay for detecting changes in inhibitory effect of BHB on cell proliferation.E: Scratch assay for detecting changes in inhibitory effect of BHB on cell migration.F: Transwell assay for detecting changes in inhibitory effect of BHB on cell migration.Scale bar:100 μm;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;###P<0.001.

2.4 BHB抑制小鼠体内的肿瘤生长

本研究构建了A549细胞裸鼠异种移植模型，进一步验证BHB的体内抗肿瘤作用。结果显示，在第21天时，BHB组的小鼠体内肿瘤质量和体积均明显小于对照组（图5A～C，P<0.05），而sh-GPR109A+BHB组小鼠肿瘤质量和体积与对照组差异无统计学意义（图5A～C，P>0.05）。BHB 组小鼠肿瘤中GPR109A 的mRNA 和蛋白表达量也均低于对照组（图5D～F，P<0.05），但sh-GPR109A+BHB组小鼠与BHB组小鼠的GPR109A表达量无明显差异（图5D～F，P>0.05）。由于BHB可能会对机体免疫系统产生影响，本研究进一步利用免疫系统正常的balb/c小鼠构建异种移植模型，实验结果显示BHB在balb/c小鼠体内同样部分通过介导GPR109A抑制肿瘤生长（图5G～L，P<0.05）。

图5 BHB的体内抗肿瘤作用Fig.5 Antitumor effect of BHB in nude mouse models bearing xenografts derived from A549 and LLC cells with or without GPR109Aknockdown.A:Gross observation of the dissected tumors on day 21.B:Comparison of tumor weight.C:Growth curve of the tumors in nude mice.D,F:mRNA and protein expressions of GPR109A in the tumor samples.G:Gross observation of the dissected tumors from Balb/c mice on day 21.H:Weight of the tumors from Balb/c mice.I:Growth curve of the tumors in Balb/c mice.J,L:mRNAand protein expression of GPR109Ain the tumor samples.*P<0.05,***P<0.001;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.

3 讨论

在肺癌的多种亚型中，肺腺癌最为常见，而且由于化疗和靶向治疗的局限，患者预后较差［2］。除了常用的手术、放疗和化疗之类的治疗手段，KD也被部分研究人员用于干预肺腺癌，例如有研究发现KD可以抑制人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的生长［16］。另有研究表明KD可抑制人神经母细胞瘤裸鼠皮下移植瘤的生长，指出其可能的抗肿瘤机制与细胞自噬有关［17］。有研究者也指出KD可在结直肠癌荷瘤小鼠体内发挥抗肿瘤效果，而且验证了KD代谢产物BHB体外抑制上皮细胞增殖和肿瘤生长［18］。上述研究表明了KD和BHB抑制肿瘤发展的潜力，但是BHB在肺癌中是否有类似作用却鲜有研究。本研究结果显示，BHB可在体外抑制肺癌A549细胞和LLC细胞的活性、增殖、迁移和侵袭能力。此外，本研究发现BHB能有效地抑制裸鼠和balb/c小鼠体内移植瘤的生长，结果初步证实了BHB对肺癌的抑制作用。

GPR109A是BHB的受体，被报道可在多种疾病中发挥调控作用，如研究发现BHB可在老年小鼠体内通过GPR109A/AMPK通路抑制肝内质网应激和脂质积累，揭示其改善与年龄相关的肝脏脂质积累的潜力［19］；有研究发现BHB可部分通过激活GPR109A直接抑制肥大细胞的功能，进而抑制Ⅱ型固有淋巴细胞介导的气道炎症［20］；另有发现BHB可通过介导GPR109A调节诸如阿兹海默症、帕金森症、中风及病理性疼痛等神经疾病［21］。基于此，本研究进一步探索BHB对A549细胞和LLC 细胞的抑制作用是否也是通过GPR109A 来介导。通过GEPIA2在线数据库分析GPR109A基因在肺腺癌中的差异化表达以及用不同浓度BHB处理A549细胞和LLC细胞，结果显示GPR109A在肺腺癌病人中的表达明显下降，而BHB处理能上调GPR109A的表达，这表明BHB对A549细胞和LLC细胞的抑制作用可能是由GPR109A介导。接着在A549细胞和LLC细胞中敲低GPR109A，并分别给予不同处理，实验结果进一步确定BHB对A549细胞和LLC细胞的抑制作用是部分通过GPR109A介导的。这些发现首次指出BHB在A549细胞和LLC细胞中部分通过介导GPR109A发挥其抗肿瘤特性的调控机制。

目前已有很多临床前研究表明KD可以抑制多种癌症［5,6］，但也有报道显示KD可以对肿瘤的发生及发展起到促进作用。例如，生酮饮食增加了血清中酮体之一的乙酰乙酸的水平，导致表达BRAF v600e的人类黑色素瘤细胞在异种移植小鼠模型中的肿瘤生长潜力增强［22］。在结节性硬化症大鼠模型中，虽然KD可以通过上调抑癌基因Nrf2、p53和OGG1α抑制肾癌的早期生长，但是长期KD 干预反而最终通过上调ERK1/2 和mTOR促进了肾癌的发展［23］。虽然摄入KD可以抑制前列腺的发展，但是在肥胖小鼠中，KD并不能延缓前列腺的进展［24,25］。上述结果表明，KD对肿瘤的作用可能因肿瘤发病原因，肿瘤局部微环境不同而发挥截然相反的作用。同时，由于患者通常对KD的依从性较差，且应用KD干预可能带来的肾结石、骨代谢异常和高胆固醇血症等潜在危害，KD的临床应用仍存在较大局限［26］。因此明确KD干预中发挥作用的关键分子可有助于解决KD临床应用的局限，而本研究的结果初步证实KD的代谢产物BHB对于肺腺癌的抗肿瘤作用，并进一步阐释了其可能的调控机制，展现了BHB替代KD用于治疗肺腺癌的前景。

综上所述，本研究证实了BHB可在体外抑制肺腺癌A549 细胞和LLC 细胞的增殖、迁移和侵袭，并且BHB可以抑制裸鼠和balb/c小鼠体内的肿瘤生长。本研究也初步确认BHB部分通过介导GPR109A来发挥其抗肿瘤作用，为BHB临床治疗肺腺癌提供了理论基础，也为解决KD治疗肺腺癌的局限提供了新的见解。