佤药娘母良药酒通过抑制凋亡对勃起功能障碍大鼠的机制研究

赵 杰，罗 艳，谢雪华，陈 瑶，方鹏强，鲍 凯，温伟波，，崔换天

（1.云南省中医医院，云南 昆明，650021；2.沧源佤族自治县班老乡卫生院，云南 临沧，677400；3.沧源佤族自治县工业和科技信息化局，云南 临沧，677400；4.云南中医药大学，云南 昆明，650500）

阴茎勃起功能障碍（erectile dysfunetion，ED）是1 种常见的男性性功能障碍，其特征是无法获得并维持足够的阴茎勃起以进行令人满意的性交，严重影响患者及其伴侣的生活质量[1]。导致ED 的因素主要有器质性因素（神经源性、血管性、糖尿病等）[2]、心理因素（表现焦虑、压力、精神障碍等）[3]、医源性因素（手术损伤引起）[4]、年龄增长（衰老）[5]等。目前临床常用西地那非、他达拉非等药物辅助治疗[6]，但越来越多的患者表现出服药效果不佳以及其他不良反应，开发更安全有效的治疗方法迫在眉睫[7]。中医药在防治ED方面表现出了特殊的优势。研究表明，补肾活血方联合他达拉非可以改善海绵体血流情况，改善ED 患者的勃起情况[8]。活血通络起痿汤联合小剂量他达拉非治疗可有效提高ED 患者的国际勃起功能指数评分[9]。马鬃蛇石油醚提取物可抑制阴茎海绵体细胞凋亡以改善ED 大鼠的勃起功能[10]。中药酒是传统医学中防治疾病、强身健体的优良食药产品。娘母良（佤文Nya Miex Tiang 的音译）作为云南佤族的1 种珍奇中草药，其炮制的药酒在佤医临床应用中颇为广泛，对强肾壮阳、安神补脑、暖宫促孕等具有明显功效[11]，但其作用机制不明。本文通过双侧髂内动脉结扎法建立ED 大鼠模型，分析娘母良药酒对ED 大鼠的影响，并基于凋亡通路探索其作用机制。

1 方法

1.1 实验动物 SPF 级健康雄性6～8 周龄SD 大鼠，60 只，体质量200～220 g，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号:SCXK （京）2019-0008。大鼠5 只/笼，饲养于室温（21 ± 2）℃，相对湿度50%～60%，明暗12 h/12 h 的环境并使大鼠自由进食饮水。

1.2 药品试剂 53%vol 茅台镇散酒（SC11552032 110418）；娘母良药酒（娘母良200 g + 53%vol 茅台镇散酒4 000 mL）；枸橼酸西地那非片（货号:H20143255，广东白云山医药集团股份有限公司）；盐酸阿扑吗啡（APO，货号:PHR2621，默克）；BCA 蛋白检测试剂盒（货号:A045-4-2），一氧化氮（NO）测定试剂盒（货号:A013-2-1）均购于南京建成生物工程研究所；大鼠环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA 检测试剂盒（货号:ml003133，酶联生物）；B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2，货号:ab59348），Bcl-2 相关X 蛋白（Bax，货号:ab32503） 均购于Abcam 上海贸易有限公司；Cleaved caspase-3 （货号:9661），Cleaved caspase-9（货号:9507）均购于Cell Signaling Technology 公司。

1.3 建立ED 模型 使用双侧髂内动脉结扎法建立ED 模型[12]。将大鼠麻醉后固定于手术台上，在腹部正中切口，分离腹壁肌肉组织，通过手术放大镜辅助，沿髂总动脉小心分离直至髂内动脉，以8-0 线结扎双侧髂内动脉。假手术组大鼠接受假手术，即按建模步骤但不予结扎。

采用APO 实验验证模型[13]:在大鼠颈项皮肤松软处注射100 μg/kg APO，记录30 min 内大鼠阴茎勃起次数，以阴茎体增长、末段阴茎体露出为阴茎勃起1 次；未检测到阴茎勃起证明模型构建成功。

1.4 分组和给药 将60 只大鼠平均分为6 组:假手术、模型、白酒、西地那非、娘母良低剂量、娘母良高剂量组。假手术组大鼠接受假手术，其余组均使用双侧髂内动脉结扎法建立ED 模型。造模成功后第1 天开始给药，西地那非组每天灌胃5 mg/kg 的西地那非，娘母良低、高剂量组每天分别灌胃3、6 mL/kg的娘母良药酒，白酒组每天灌胃等体积等度数白酒，假手术与模型组每天分别灌胃等体积的生理盐水作为平行对照，各组均给药持续28 d。给药结束后，所有大鼠进行APO 勃起实验，之后被处死，称重并收集样本。

1.5 附睾和睾丸指数检测 取各组大鼠睾丸，称质量后放入4%的多聚甲醛中备用。

脏器指数= 脏器质量/ 体质量× 100%。

1.6 附睾精子数量及存活率检测 取大鼠右侧附睾浸泡于37 ℃生理盐水中，制备精子悬液，取10 μL 混匀的精子悬液，滴于血细胞计数板中，显微镜下计数精子数量，N = 镜下精子数目/ 100 × 106/mL；根据精子的活动情况，统计活动精子数，M = 镜下活动精子数目/ 100 × 106/mL，计算精子活率。

精子活率= M / N × 100%。

1.7 阴茎勃起相关生物活性因子测定 完成上述实验后，将大鼠下腹及会阴消毒，灭菌动物手术器械将大鼠阴茎从根部剪断，迅速取出龟头和包皮组织，灭菌生理盐水漂洗阴茎，阴茎后端放入4%的多聚甲醛中备用。称取阴茎前端100 mg，剪碎，匀浆。按照生化试剂盒和ELISA 试剂盒说明书分别检测NO、cGMP含量。

1.8 阴茎海绵体与睾丸组织病理学染色 将置于4%多聚甲醛固定的大鼠阴茎海绵体组织及睾丸组织脱水，石蜡包埋，切片，常规HE 染色，中性树胶封片，显微镜下观察大鼠海绵体与睾丸组织病理变化。

1.9 Western blot 检测阴茎组织中凋亡相关蛋白表达 提取阴茎海绵体组织蛋白后，电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF 膜后，浸5%脱脂奶粉于摇床上室温封闭2 h，将封闭后的膜置于对应一抗稀释液中（Bcl-2，1 ∶10 000；Bax，1 ∶1 000；Cleaved caspase-3，1 ∶1 000；Cleaved caspase-9，1 ∶1 000）4 ℃过夜。使用封闭液按1 ∶6 000 稀释二抗，温室孵育2 h，置于化学发光仪中曝光。

1.10 数据处理 数据利用SPSS 25.0 统计软件进行数据处理及统计分析，计量资料采用均数± 标准差（±s）表示，采用独立样本t 检验，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）统计；方差不齐采用秩和检验，以P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠勃起功能比较 APO 实验结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的勃起次数显著降低（4.10 ± 0.54 vs.0.90 ± 0.70，P＜0.01）；与模型组相比，白酒组无明显差异（0.90 ± 0.70 vs.1.10 ± 0.70，P＞0.05），西地那非组与娘母良低、高剂量组大鼠的勃起次数均显著增多（0.90 ± 0.70 vs.2.60 ± 0.49，P＜0. 01；0.90 ± 0.70 vs.1.70 ± 0.46，P＜0. 05；0.90 ± 0.70 vs.2.30± 0.64，P＜0.01）；与白酒组相比，娘母良低、高剂量组均显著增多（1.10 ± 0.70 vs.1.70 ± 0.46，P＜0. 05；1.10 ±0.70 vs.2.30 ± 0.64，P＜0.01）；与西地那非组相比，娘母高剂量组无明显差异（2.60 ± 0.49 vs.2.30 ± 0.64，P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠勃起次数

2.2 各组大鼠附睾与睾丸的质量及指数比较 结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的附睾质量、睾丸质量、附睾指数、睾丸指数均显著降低（0.88 ± 0.08 vs 0.39 ± 0.07，1.93 ± 0.18 vs 0.96 ± 0.12，0.25 ± 0.02 vs 0.10 ± 0.02，0.54 ± 0.05 vs 0.25 ± 0.03，均P＜0.01）；与模型组相比，白酒组无明显差异（0.39 ± 0.07 vs 0.35 ±0.08，0.96 ± 0.12 vs 0.93 ± 0.10，0.10 ± 0.02 vs 0.09 ±0.03，0.25 ± 0.03 vs 0.24 ± 0.05，均P＞0.05），西地那非组与娘母良各剂量组均显著升高（西地那非组，0.39 ±0.07 vs 0.72 ± 0.09，0.96 ± 0.12 vs 1.65 ± 0.17，0.10 ±0.02 vs 0.20 ± 0.03，0.25 ± 0.03 vs 0.46 ± 0.05，均P＜0.01；娘母良低剂量组，0.39 ± 0.07 vs 0.45 ± 0.08，0.96± 0.12 vs 1.34 ± 0.17，0.10 ± 0.02 vs 0.13 ± 0.03，均P＜0.01，0.25 ± 0.03 vs 0.38 ± 0.04，P＜0.05；娘母良高剂量组，0.39 ± 0.07 vs 0.78 ± 0.11，0.96 ± 0.12 vs 1.70 ±0.17，0.10 ± 0.02 vs 0.22 ± 0.03，0.25 ± 0.03 vs 0.48 ±0.04，均P＜0.01）；与白酒组相比，娘母良低、高剂量组显著升高（娘母良低剂量组，0.35 ± 0.08 vs 0.45 ±0.08，P＜0.05，0.93 ± 0.10 vs 1.34 ± 0.17，0.09 ± 0.03 vs 0.13 ± 0.03，0.24 ± 0.05 vs 0.38 ± 0.04，均P＜0.01；娘母良高剂量组，0.35 ± 0.08 vs 0.78 ± 0.11，0.93 ± 0.10 vs 1.70 ± 0.17，0.09 ± 0.03 vs 0.22 ± 0.03，0.24 ± 0.05 vs 0.48 ± 0.04，均P＜0.01）；与西地那非组相比，娘母良高剂量组无明显差异（0.72 ± 0.09 vs 0.78 ± 0.11，1.65 ±0.17 vs 1.70 ± 0.17，0.20 ± 0.03 vs 0.22 ± 0.03，0.46 ±0.05 vs 0.48 ± 0.04，均P＞0.05）。见图2。

图2 各组大鼠附睾与睾丸的质量及指数

2.3 各组大鼠精子质量比较 结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的精子数量及存活率均显著降低（84.00 ± 10.90 vs.5.40 ± 1.70，86.31 ± 5.73 vs.28.59 ±18.15，均P＜0.01）；与模型组相比，白酒组无明显差异（5.40 ± 1.70 vs.5.80 ± 0.75，28.59 ± 18.15 vs.32.70 ±10.20，均P＞0.05），西地那非组与娘母良各剂量组均显著升高（西地那非组，5.40 ± 1.70 vs.71.10 ± 7.09，28.59 ± 18.15 vs.69.02 ± 5.32，均P＜0.01；娘母良低剂量组，5.40 ± 1.70 vs.47.00 ± 4.30，28.59 ± 18.15 vs.48.90 ± 4.81，均P＜0.01；娘母良高剂量组，5.40 ± 1.70 vs.67.05 ± 4.49，28.59 ± 18.15 vs.74.76 ± 3.31，均P＜0.01）；与白酒组相比，娘母良组显著升高（娘母良低剂量组，5.80 ± 0.75 vs.47.00 ± 4.30，32.70 ± 10.20 vs.48.90 ± 4.81，均P＜0.01；娘母良高剂量组，5.80 ± 0.75 vs.67.05 ± 4.49，32.70 ± 10.20 vs.74.76 ± 3.31，均P＜0.01）；与西地那非组相比，娘母良高剂量组精子数量无明显差异，精子活率显著升高（71.10 ± 7.09 vs.67.05 ± 4.49，P＞0.05，69.02 ± 5.32 vs.74.76 ± 3.31，P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠精子质量

2.4 各组大鼠阴茎海绵体与睾丸病理的变化 HE结果显示，假手术组大鼠阴茎海绵体组织形态正常，血窦丰富且排列规则，内皮细胞完整且均匀分布于血管壁上；模型组和白酒组大鼠阴茎海绵体组织血窦减少并分布紊乱、内皮细胞损伤并且密度降低等病理变化；西地那非与娘母良干预后阴茎海绵体组织形态逐渐恢复正常。见图4。

图4 各组大鼠阴茎海绵体组织HE 染色（100×）

假手术组大鼠睾丸组织生精细胞结构正常，层次规则，生精小管管腔饱满，各生精小管之间接触紧密，仅有部分生精小管呈空腔状态，说明大部分的精子细胞完好；模型组大鼠睾丸组织生精细胞结构异常，排列紊乱，生精小管管腔缩小，各生精小管之间的间隙明显变宽；西地那非与娘母良干预后睾丸组织形态逐渐恢复正常。见图5。

图5 各组大鼠睾丸组织HE 染色（100×）

2.5 各组大鼠NO/cGMP 信号传导变化 结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的NO 和cGMP 水平均显著降低（5.16 ± 0.73 vs.2.18 ± 0.50，1.90 ± 0.37 vs.0.41 ± 0.08，均P＜0.01）；与模型组相比，白酒组无明显差异（2.18 ± 0.50 vs.1.98 ± 0.52，0.41 ± 0.08 vs.0.43 ±0.05，均P＞0.05），西地那非组与娘母良各剂量组均显著升高（西地那非组，2.18 ± 0.50 vs.3.98 ± 0.43，0.41 ±0.08 vs.1.49±0.36，均P＜0.01；娘母良低剂量组，2.18±0.50 vs.3.21 ± 0.42，0.41 ± 0.08 vs.0.93 ± 0.18，均P＜0.01；娘母良高剂量组，2.18 ± 0.50 vs.4.28 ± 0.45，0.41 ± 0.08 vs.1.56 ± 0.35，均P＜0.01）；与白酒组相比，娘母良组显著升高（娘母良低剂量组，1.98 ± 0.52 vs.3.21 ± 0.42，0.43 ± 0.05 vs.0.93 ± 0.18，均P＜0.01；娘母良高剂量组，1.98 ± 0.52 vs.4.28 ± 0.45，0.43 ± 0.05 vs.1.56 ± 0.35，均P＜0.01）；与西地那非组相比，娘母良高剂量组无明显差异（3.98 ± 0.43 vs.4.28 ± 0.45，1.49 ±0.36 vs.1.56 ± 0.35，均P＞0.05）。见图6。

图6 各组大鼠NO/cGMP 信号传导

2.6 各组大鼠凋亡相关蛋白变化 Western blot 结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠Bax/Bcl-2，Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 的蛋白表达水平均显著升高（0.08± 0.02 vs.1.00 ± 0.00，0.26 ± 0.02 vs.1.00 ± 0.00，0.27 ± 0.06 vs.1.00 ± 0.00，均P＜0.01）；与模型组相比，白酒组无明显差异（1.00 ± 0.00 vs.0.93 ± 0.05，1.00 ± 0.00 vs.0.99 ± 0.05，1.00 ± 0.00 vs.1.06 ± 0.06，均P＞0.05），西地那非组与娘母良组不同程度降低（西地那非组，1.00 ± 0.00 vs.0.14 ± 0.02，1.00 ± 0.00 vs.0.35 ± 0.04，1.00 ± 0.00 vs.0.66 ± 0.02，均P＜0.01；娘母良低剂量组，1.00 ± 0.00 vs.0.39 ± 0.03，1.00 ± 0.00 vs.0.58 ± 0.08，均P＜0.01，1.00 ± 0.00 vs.1.13 ± 0.11，P＞0.05；娘母良高剂量组1.00 ± 0.00 vs.0.16 ± 0.02，1.00 ± 0.00 vs.0.38 ± 0.05，1.00 ± 0.00 vs.0.67 ± 0.09，均P＜0.01）；与白酒组相比，娘母良组显著降低（娘母良低剂量组，0.93 ± 0.05 vs.0.39 ± 0.03，0.99 ± 0.05 vs.0.58 ± 0.08，均P＜0.01，1.06 ± 0.06 vs.1.13 ± 0.11，P＞0.05；娘母良高剂量组0.93 ± 0.05 vs.0.16 ± 0.02，0.99 ± 0.05 vs.0.38 ± 0.05，1.06 ± 0.06 vs.0.67 ± 0.09，均P＜0.01）；与西地那非组相比，娘母良高剂量组无明显差异（0.14 ± 0.02 vs.0.16 ± 0.02，0.35 ±0.04 vs.0.38 ± 0.05，0.66 ± 0.02 vs.0.67 ± 0.09，均P＞0.05）。见图7。

图7 各组大鼠凋亡相关蛋白表达

3 讨论

中医认为ED 是经由肝郁、湿热、瘀滞、命门火衰、阴虚火旺、阴虚火旺、心脾血虚等原因致病。娘母良具有补肾助阳、养心安神、祛痰解痉的功效[11]。临床应用于肾虚阳萎、早泄等性功能减退症以及心悸怔忡、肾虚咳喘、宫寒带下等证[12]。并且，佤族民间早已验证其强壮、增力、抗疲劳作用，是1 种纯天然强壮剂。娘母良药酒在娘母良的基础上组方而成，具有舒筋活血、补肾助阳的功效[13]。

在本文的研究中，采用双侧髂内动脉结扎法建立ED 大鼠模型，使用APO 检测造模成功与否。结果显示ED 模型大鼠的勃起功能受限，而娘母良药酒干预后ED 大鼠的勃起功能有所恢复。当ED 发生时，会出现精子质量低下，阴茎海绵体和睾丸组织形态改变的现象。娘母良药酒干预后对ED 大鼠的精子质量以及阴茎海绵体和睾丸的病理具有明显改善。NO/cGMP信号传导在阴茎勃起中发挥关键作用。NO 刺激可溶性鸟苷环化酶，将三磷酸鸟苷转化为cGMP，进而激活蛋白激酶，有利于海绵体平滑肌的松弛，并增强血液流入阴茎，导致阴茎勃起[14]。我们的结果发现ED大鼠的NO 和cGMP 产生受损，但娘母良药酒干预后NO 和cGMP 水平明显提升。在这些结果中，西地那非组和娘母良药酒组相比没有明显差异，说明娘母良药酒可能是1 种可以代替西地那非改善ED 的潜在药物。白酒组与模型组相比没有明显差异，白酒组与娘母良药酒组相比具有明显差异，说明娘母良在ED 大鼠勃起功能恢复过程中发挥了重要的作用。以上内容验证了娘母良药酒对ED 具有良好的改善作用。

细胞凋亡是1 种受基因调控的有序、自发的细胞死亡形式，是维持细胞和器官正常功能的重要病理生理过程[15]。此外，细胞凋亡也是ED 的关键病理机制，可能导致海绵体缺血，从而削弱勃起功能[16-17]。既往研究报道，Akt/Bad/Bax/Caspase-3 通路可显著预防海绵体神经损伤大鼠的体细胞凋亡[18]。五子衍宗方通过抑制细胞凋亡，有效改善与衰老相关的睾丸功能障碍[19]。Bcl-2 蛋白家族被认为是细胞凋亡的关键调节因子[19]。Bcl-2 具有抗凋亡作用，Bax 具有促凋亡作用，二者可形成二聚体发挥作用。Bcl-2/Bax 比率降低可能会导致线粒体功能障碍，Bcl-2/Bax 的平衡是决定细胞凋亡程度的主要因素[20]。当Bax-Bcl-2 二聚体增多时，可以促进线粒体穿孔，通过释放细胞色素c启动细胞凋亡的过程，它激活Caspase 级联，导致细胞破坏[21]。Caspase-9 是1 种起始caspase，在caspase-3/-7 上游发挥作用。细胞色素c 从线粒体释放到细胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子1 结合形成凋亡体，最终激活Procaspase-9[22]。Procaspase-9 然后在大亚基和小亚基之间的亚基间连接子处裂解激活Pro caspases-3[23]。在本研究中，Wesrern blot 结果表明，ED大鼠Bax/Bcl-2 比例、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 表达升高，而娘母良药酒干预后Bax/Bcl-2比例、Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 表达下降，表明娘母良药酒可能是通过抑制细胞凋亡改善ED。

综上所述，娘母良药酒可以促进NO 与cGMP 的产生并抑制阴茎海绵体组织细胞凋亡进而改善ED大鼠勃起功能。见图8。本研究对娘母良药酒治疗ED大鼠的效果及机制进行了初步探索，以期为娘母良药酒的临床应用提供实验基础和理论依据。然而，娘母良药酒对ED 的深入作用机制，还需要在未来进行多角度的研究。

图8 图形摘要