层层自组装修饰PLGA纳米载体的制备及药物释放

郭 俊,童 菲,王 沛

(1.南昌大学附属口腔医院a.牙体牙髓病科; b.正畸一科; c.中心实验室; 2.江西省口腔生物医学重点实验室; 3.江西省口腔疾病临床医学研究中心,南昌 330006)

如何有效实现药物的可控与持续释放,以及提高其有效性、降低不良反应,是功能性药物载体所面临的重要挑战[1]。纳米药物载体的表面化学修饰因反应剧烈,且易破坏纳米粒的结构,一直是一个技术难点。层层自组装技术(Layer-by-layer self-assembly technology,LbL技术)主要利用聚电解质的静电作用进行表面修饰,反应温和、操作简单、可控性强,为纳米载体的功能多样化提供新思路[2-3]。近年来,LbL技术在纳米药物载体方面的应用越来越多,LbL纳米药物载体凭借其多功能性和结构的可控性而备受关注[4-5]。例如LbL纳米药物载体容易实现化疗和基因治疗的结合,负载功能基团表现出的刺激响应控释,连接靶向基团对癌细胞表现出的靶向性[6]。聚鸟氨酸(Poly-L-ornithine,PLO)是由L-鸟氨酸组成的聚阳离子,其侧链上有一个伯胺。且PLO是一种低免疫源性的聚阳离子化合物,具有多种生物活性和良好的生物安全性[7-8]。岩藻聚糖(Fucoidan,Fu)是海带等褐藻所固有的细胞间多糖,存在于褐藻细胞壁基质中,是褐藻所特有的生物活性物质。主要由L-岩藻糖组成,并以α-1,3糖苷键连接,含有大量硫酸酯基团。岩藻聚糖作为聚阴离子具有抗凝血、降血脂、增强机体免疫机能等多种生理活性,以及诱导肿瘤细胞凋亡的能力[9-10]。实现靶器官、靶组织或靶细胞等特定的生理位置释放药物,是靶向药物载体的最终目标。纳米药物特异性识别肿瘤细胞有助于提高其在肿瘤部位的滞留量,以减少不良反应和提高疗效[11-12]。核仁素是真核细胞核仁中的主要蛋白质,在肿瘤细胞膜表面大量表达,充当多种蛋白质分子的共受体,可以作为肿瘤药物的标记物。核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术的体外筛选技术,将核酸分子库中得到的寡核苷酸片段,折叠成明确的三维结构,为其与靶分子特异性结合提供基础[13-14]。核酸适配体(Aptamer,Apt)AS1411对核仁素具有较高的亲和力[15],AS1411含有26个核苷酸,能形成稳定的G-四链体结构,其序列是5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3′。

本文选用PLGA纳米粒负载抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin,Dox)(PD NPs),然后利用聚鸟氨酸和岩藻聚糖层层自组装PD NPs。并将含有氨基的PLO和含有醛基的CHO-PEG-COOH进行醛胺反应形成接枝共聚物,再与氨基修饰的AS1411进酰胺反应结合,最后自组装到纳米粒,构建具有靶向功能的层层自组装纳米粒。同时,优化工艺条件,表征纳米粒各项理化性能,使其严格符合给药要求。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

PLO(分子量30～70 kDa)购买于西格玛奥德里奇试剂有限公司;Fucoidan(分子链200～400 kDa)购买于山东洁晶集团股份有限公司;阿霉素(纯度≥98%)购买于大连美伦生物技术有限公司。

1.2 负载Dox的PLGA纳米粒的制备

利用超声乳化溶剂挥发法制备负载Dox的PLGA NPs(PD NPs),将20 mg的PLGA溶于1 mL 二氯甲烷作为油相置于冰浴中,4 mL 2%的BSA水溶液(即80 mg的BSA溶于4 mL水)和3 mg 的Dox为水相,用注射器将油相逐滴加入水相中,冰浴下功率1000 W超声60 s,立刻将乳液倒入100 mL超纯水中,磁力搅拌5 h挥发有机相。12 000 转、10 min离心收集纳米粒,超纯水清洗3次,冷冻干燥后4 ℃冰箱保存。

1.3 PLO-g-PEG-COOH共聚物的合成及检测

将92 mg的PLO溶于7 mL的pH 8.5的四硼酸钠缓冲液中,使鸟氨酸单体的浓度达到100 mmol·L-1。随后加入173 mg的OHC-PEG-COOH(Mw 2 kDa)。室温下搅拌6 h,混合物装入截留分子量8～12 kDa的透析袋置于超纯水中透析,每隔12 h换1次超纯水除去未反应的OHC-PEG-COOH,透析时间为4 d。冷冻干燥后在-20 ℃下保存。

分别对PLO、CHO-PEG-COOH和PLO-g-PEG-COOH进行核磁共振氢谱(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)和红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)检测。

1.4 层层自组装PD NPs的制备

将1 mg·mL-1的PLO溶液调节pH为4.0,1 mg·mL-1岩藻聚糖溶液用0.22 μm滤膜过滤后调节pH为9.0。按照纳米粒：聚电解质=1：1的比例进行层层组装,每层搅拌时间20 min;组装完一层后,离心得到组装后的纳米粒,再组装下一层。最后一层组装聚电解质为PLO-g-PEG-COOH,得到层层自组装PD NPs(LPD NPs)。

1.5 核酸适配体AS1411的修饰及检测

将1 mg·mL-1的纳米粒在100 μL的乙醛(CH3CHO)溶液中孵化10 min封闭掉多余的氨基(-NH2)。水洗2遍,然后将纳米粒和1 mg的NaBH4反应10 min,减少席夫基团。水洗2遍,加入0.5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺以活化羧基,15 min 后加入1 mL的1 mg·mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2 μg的AS1411-NH2,震荡下反应15 min,得到修饰AS1411的纳米粒(LAPD NPs)。

为了检测核酸适配体AS1411连接到LPA NPs,通过琼脂糖凝胶电泳检测。将6×loading buffer(2 μL)和10 μL样品混合均匀后,分别加入不同的加样孔内,进行电泳。将分散后的纳米粒滴在300目的铜网上,置于真空干燥箱中过夜干燥,然后进行透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)来观察纳米粒的形貌。

1.6 层层自组装过程的监测

通过石英微晶天平(Quartz crystal microbalance,QCM)监测层层自组装的过程。在0.5 mol·L-1的NaCl溶液中建立稳定的基线,石英晶体的电极吸附0.5 mg·mL-1的(PLO/Fucoidan),每层吸收15 min,0.5 mg·mL-1的PLO-g-PEG-COOH注入15 min,0.1 mg·mL-1乙醛(CH3CHO),0.5 mg·mL-1的NHS和EDC,10 μg·mL-1的AS1411-NH2依次泵入,保持20 min,石英微晶天平记录其变化量。将每次组装后的样品取0.5 mg测定其Zeta电位,以确定每一层是否组装上相应的聚电解质。

1.7 载药自组装微球对Dox的释放率的测定

紫外-可见分光光度计在波长300～800 nm的范围内对Dox溶液扫描,判断Dox的最大吸收峰为480 nm,并测定Dox在纯水和pH 7.4的PBS溶液中的标准曲线,计算载药量和包封率。将LAPD NPs装入透析袋中,分别置于pH 5.5和pH 7.4的PBS溶液中,于37 ℃、100 转·min-1摇床中进行药物释放。每隔0.5、1、2、4、6、9、12、24 h…取样,并加入同体积的PBS溶液。在480 nm波长处检测紫外吸收值,计算释放的Dox浓度,绘制药物释放曲线。

2 结果与讨论

2.1 PD NPs的形貌

利用牛血清白蛋白作为表面活性剂,通过超声乳化溶剂挥发法制备了负载Dox的PLGA NPs(PD NPs),其TEM如图1A和1B所示。通过TEM观察其形貌可以看到PD NPs分散性良好、大小均一、球形度完整,平均粒径为100 nm左右。说明乳化溶剂挥发法不仅操作简单,而且制备得到的样品质量好,牛血清白蛋白作为表面活性剂既能保证纳米粒的稳定性,又能维持其分散性。

2.2 PLO-g-PEG-COOH的验证

通过核磁共振氢谱和傅立叶红外光谱检测合成的产物,如图2A所示通过1H-NMR对所得产物PLO-g-PEG-COOH结构进行验证,化学位移4.7处为D2O的特征峰,化学位移1.6、2.9、4.3处为PLO的特征峰,3.6处为PEG的特征峰,在PLO-PEG的氢谱图中化学位移都向左发生偏移,且1.6处化学位移变宽,说明PLO-g-PEG-COOH成功合成。在红外光谱图2B中,PLO-g-PEG-COOH在波数2800 cm-1处有一个强吸收单峰,是-CHO的吸收峰,在PLO和PLO-g-PEG-COOH中没有出现这样的强吸收单峰,此实验结果表明PLO和PEG成功结合为接枝共聚物。

A:核磁共振氢谱;B:红外光谱图。图2 PLO、CHO-PEG-COOH、PLO-g-PEG-COOH的表征检测

2.3 层层自组装的监测结果

为了观察聚电解质静电吸附层层自组装PD NPs的过程,通过石英微晶天平来实时监测,用Zeta电位检测层层自组装的表面修饰。如图3A所示,首先通入NaCl溶液,依次是组装上的PLO、Fucoidan等。为了连接核酸适配体AS1411,组装接枝共聚物PLO-g-PEG-COOH,加入的乙醛溶液及NHS和EDS,最后一个是共价结合上的AS1411。通过观察基线的变化可以看出,每一层都成功组装上了LPD NPs。且每组装一层都没有降低上一层聚电解质的吸附,说明层层自组装的聚电解质层稳定性良好。此外,如图3B所示,由于牛血清白蛋白作为其表面活性剂,故PD NPs的Zeta电位为负值,约为-38 mV。PLO为聚阳离子,故组装后的PD-PLO NPs的Zeta电位为正值,实现了电荷的反转。Fucoidan为聚阴离子,故组装后的PD-(PLO/Fu) NPs的Zeta电位为负值。同样的原理,每组装一层都实现了Zeta电位的翻转,也说明了聚电解质成功地层层自组装到PD NPs上。

A:石英微晶天平(QCM)扫描图;B:Zeta电位检测。图3 层层自组装过程的监测

2.4 LAPD NPs的理化性质表征

为了进一步确定核酸适配体AS1411成功连接到纳米粒上,进行了琼脂糖凝胶电泳检测。如图4所示,电泳加样孔中A是核酸适配体AS1411,B是纳米粒,C是LPD NPs和AS1411的混合,D是LPA NPs。A、C和D有荧光,而B没有荧光,因为B中不含有核酸。且A和C的核酸在电泳中的位置相同,而D的核酸位置在加样孔附近,说明通过共价结合的纳米粒和AS1411结合牢固,而LPD NPs和AS1411简单结合后并不牢固。故聚电解质成功地组装上PLGA纳米粒,且纳米粒和AS1411结合牢固。在凝胶电泳电流的作用下,LAPD NPs上的AS1411结合牢固,也说明层层自组装纳米粒的稳定性良好,受电流的影响不明显。

A:AS1411;B:LP NPs;C:LPD NPs和AS1411的混合;D:LAPD NPs。

LAPD NPs的形貌见图5,与未组装前的PD NPs相比,其粒径略有增大,平均粒径约为150 nm。LAPD NPs呈核壳型结构,粒径大小均一,球形度完整,自组装效果良好。说明通过温和的层层自组装过程并不会改变纳米粒的形态,且最外层修饰上核酸适配体AS1411的过程也对纳米粒的形态影响很小。综上,由于静电作用层层自组装温和的表面修饰,故对纳米粒的形貌及理化性质影响很小。

A:较小倍数(scale bar=0.5 μm);B:较大倍数(scale bar=50 nm)。图5 载药后的LAPD NPs的形貌(TEM)

2.5 LAPD NPs的药物释放

根据测定的Dox的标准曲线计算LAPD NPs的载药量及药物释放曲线。如图6A所示,Dox的最大吸收峰在480 nm处。图6B所示,Dox在PBS中的标准曲线为:y=0.018 0x-0.003,回归系数R2为0.999 3,说明其线性相关性良好。通过Dox的标准曲线,计算LAPD NPs的载药量为(2.32±0.04)%,包封率为(15.89±0.31)%。随后,对LAPD NPs的体外释药行为进行测定,Dox的体外释放情况见图7。在模拟生理环境(pH=7.4)的条件下,LAPD NPs持续缓慢地释放出Dox,28 d的释放时间内,Dox的累积释放率约为55%,说明Dox仍持续地从纳米粒中释出。随着药物的持续释放,自组装层之间的组分减少,可能导致聚电解质之间的静电作用减弱,故造成400 h后Dox的释放率显著升高,且释放速率越来越高。LAPD NPs的释药曲线可表明具有良好的药物缓释能力。

A:Dox全波长扫描;B:Dox在pH 7.4的PBS中标准曲线。图6 Dox的性质检测

图7 LAPD NPs中阿霉素释放曲线

3 结论

本文构建的LAPD NPs首先利用超声乳化溶剂挥发法制备负载Dox的PLGA纳米粒,其次通过层层自组装技术包裹上聚鸟氨酸和岩藻聚糖,最后连接核酸适配体AS1411赋予其靶向功能。超声乳化溶剂挥发法制备的PD NPs大小均一,粒径约为100 nm,其Zeta电位约为-30 mV,利于聚电解质的负载。通过石英微晶天平观察了其层层自组装过程,每组装一层其基线的变化说明了聚电解质组装成功,且Zeta电位的正负翻转也证实了这点。此外,合成了接枝共聚物PLO-g-PEG-COOH,并通过酰胺反应连接靶向基团核酸适配体AS1411。经核磁共振氢谱和红外光谱验证了聚合物的结构,并通过琼脂糖凝胶色谱检测核酸适配体的成功键接。对载药纳米粒LAPD NPs进行了载药率、包封率和药物释放率的测定,结果显示LAPD NPs具有缓慢释放药物特性。故LAPD NPs通过静电作用的层层自组装技术实现了纳米药物载体的多种功能,这种弱相互作用力结合的形式相对化学键结合更方便且易操作。