清营颗粒对大鼠的急性毒性研究*

刘月月，杨世发，李克鑫，殷斌，赵增成，林树乾**

（1.山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250100；2.动物保健品山东省工程研究中心，山东 济南 250100；3.山东鑫谷健康产业有限公司，山东 滨州 256600）

清营颗粒是由清营汤改造而来，清营汤为清热剂，组方来自于我国中药古籍《温病条辨》，由犀牛角（水牛角代替）、生地黄、银花、连翘、玄参、丹参、麦冬、黄连、竹叶心组成，能够清热解毒，透热养阴，主治热入营分证。据记载，清营汤在过去广泛用于治疗太阴温病、手厥阴暑温、暑痫、阳明温病等。现代药理学研究也发现，利用清营汤合生脉散加减可用来治疗临床脓毒症[1]及别嘌醇过敏致急性肾损伤[2]，而且对治疗热毒血瘀型糖尿病肾病也起到一定的积极作用[3]。此外，清营汤加减与寿胎灌肠汤联合使用可改善特发性畸形精子症[4]；清营汤加减联合刺络拔罐可用于治疗阴虚内热型面部激素依赖性皮炎[5]。在兽医临床方面，有研究报道清营口服液对鸡大肠杆菌病[6]和流感病毒病[7]均具有较好的疗效。但是，饮水用药方式容易发生堵塞水道等问题。为了方便使用，我们将现有的口服液改变为颗粒剂，并以SD 大鼠为研究对象，采用限量法进行试验，探究清营颗粒的急性毒性效应。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

清营颗粒：水牛角、生地黄、金银花、黄连等药物煎煮后加辅料制成颗粒剂，每1 g 成品含原生药材1 g。药材均购于山东百味堂中药饮片有限公司。试验时采用灭菌水配制成0.5 g/mL 的受试药物，现用现配。

苦味酸，批号20191101，由广东省台山市化工厂生产；水合氯醛，批号20190823，由永华化学科技（江苏）有限公司生产。

1.2 试验动物

SPF 级6～7 周龄SD 大鼠20 只，雌、雄各10只，体重180～220 g，购自三峡大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK（鄂）2022-0012]。

1.3 主要仪器

双扉脉动真空蒸汽灭菌器（YMQ 型），购自连云港佑源医药设备有限公司；电子天平（SQP型），购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.4 试验方法

选取SD 大鼠20 只（雌、雄各10 只），禁食不禁水14 h 后，通过灌胃给予0.5 g/mL 受试药物，每天灌服三次，每次间隔4 h，每次灌服剂量为10.0 g/kg 体重，即每天灌服剂量为30.0 g/kg 体重。染毒后3 h 内恢复饲喂。

1.5 临床观察

观察频率：染毒前观察1 次，染毒后每天观察，连续14 d；观察对象：染毒前全部大鼠，染毒后试验中所有存活大鼠；内容：观察包括皮肤、被毛、眼、黏膜、分泌物、排泄物以及呼吸、循环、自主和中枢神经系统等，特别要注意观察有无震颤、惊厥、流涎、腹泻、呆滞、嗜睡和昏迷等症状。记录局部和全身反应，记录大鼠中毒体征的出现时间、程度和持续时间，评估可能的毒作用靶器官。

1.6 体重测定

在染毒当天（视为0 d），染毒后1、2、7、14 d 上午测定所有存活大鼠的体重。

1.7 解剖观察

对试验过程中死亡的大鼠及试验结束时存活的大鼠进行解剖，肉眼观察大鼠体表、所有体表孔窍、头颅、胸部、腹部、骨盆等处及其内容物有无异常，并进行记录。观察重要器官（心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、子宫、卵巢、胃肠、脑等）的解剖病变。

1.8 数据分析

1.8.1 最大耐受量 灌服一定剂量的清营颗粒后，观察期内无大鼠死亡，则认为该受试品对大鼠的经口急性毒性耐受剂量大于受试剂量，即LD50大于该数值。

1.8.2 毒性分级 急性毒性分级见表1。根据表1级别标准确定清营颗粒的毒性级别。

表1 化学物急性毒性（LD50）剂量分级表[8--9]

2 结果

2.1 临床观察

大鼠临床观察结果见表2。在给予30 g/kg 体重的清营颗粒后，雌性大鼠精神状态良好，饮食正常，大小便正常，直至试验结束无异常症状出现；仅有一只雄性大鼠在给药2 d 后出现粪便软但成形情况，可能不是药物引起，其他大鼠无异常症状。

2.2 体重测定

大鼠体重称量结果见表3。所有动物在给药后14 d 天存活，其中4 只雌性动物在给药后1 d 或2 d体重降低，其他动物体重持续增长。雄性动物在给药后1、2、7 d 和14 d，体重持续增长。

表3 大鼠体重测定结果 单位：g

2.3 解剖观察

大鼠解剖观察结果见表4。剖检显示，动物外观（皮肤、皮下肌肉）未见明显异常，呼吸系统（气管、肺、咽喉、鼻）、消化系统（食管、胃肠、胰腺、肝等）、泌尿生殖系统（肾、膀胱、睾丸、附睾、子宫、卵巢等）、神经系统（脑、脑垂体、眼、脊髓等）、腺体（肾上腺、胸腺）、心血管及造血系统（主动脉、心脏等）等未见肉眼可观病变。

表4 大鼠解剖观察结果

3 讨论

清营颗粒是在新兽药清营口服液基础上优化生产工艺改变剂型而得，跟口服液相比，颗粒剂具有口味改进、方便使用、性质稳定、易储存等优势。前期通过药效试验发现，清营口服液能对鸡体内注射的大肠杆菌起到较好的抑菌和杀菌效果；与其他药物进行比对，发现清营口服液总体预防和治疗效果好于氟苯尼考[6]。以小鼠（C57BL/6）和MDCK 细胞作为模型，通过使用临床分离到的禽流感病毒攻毒来研究清营口服液抑制流感病毒复制的效果，结果发现其对禽流感病毒有明显抑制作用，且吸附前期抑制效果最好，免疫荧光试验结果表明清营口服液能够有效抑制病毒NP 蛋白核输出[7]。本研究中受试品清营颗粒的前期药理学研究结果显示，其可有效缓解大肠杆菌内毒素引起的高热以及禽流感病毒感染引起的热入营分等症状。然而，关于清营颗粒的毒性作用尚未研究，本试验以此为目的，以期为药物的开发提供依据。

在试验动物选择方面，按照《GB15193.3-2014食品安全国家标准急性经口毒性试验》[9]中的要求，选择啮齿类动物大鼠。SD 大鼠是毒性试验常用的啮齿类动物，遗传背景清楚，对药物的反应比较稳定，个体差异较小，饲养管理方便，体形较小，便于试验操作。为了观察受试药物对不同性别动物生长发育的影响，使用雌、雄两种性别的健康成年大鼠各10 只，体重为180～220 g。

本次试验采用限量法，该方法适用于有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试品，给予动物一定剂量的受试品仍不出现死亡[9]。本次试验的受试品——清营颗粒，主要成分为生地黄、水牛角、金银花和玄参，这些中药单用或组成方剂使用已经十分成熟，有关药效和药理的研究也多有报道，目前在宠物临床或家禽养殖上也有广泛而有效的应用[10-15]，因此，初步估计受试品清营颗粒毒性极小，本次试验选用限量法是合适的。

研究结果显示，在本试验条件下，受试品清营颗粒对雌性和雄性SD 大鼠的急性经口毒性耐受剂量大于30 g/kg 体重，其LD50大于30 g/kg 体重。根据化学物急性毒性（LD50）剂量分级标准，清营颗粒无毒。本研究结果为后续长期毒性试验剂量的设计和临床试验起始剂量的选择提供一定的参考。