尿液NGAL、KIM-1、TFF3联合检测对肝硬化患者急性肾小管坏死的诊断价值

龚艳清,赵 莹,贾艳会,李 熳,江 勇

龚艳清,赵莹,李熳,江勇,天津医科大学第二医院消化内科 天津市 300211

贾艳会,天津市第三中心医院检验科 天津市 300100

0 引言

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)在住院的肝硬化患者发病率可达19%-20%,与患者预后不良相关,死亡率极高[1,2],主要分为肾前性氮质血症(prerenal azotemia,PRA)、肝肾综合征急性肾损伤型(hepatorenal syndrome-AKI,HRS-AKI)和急性肾小管坏死(acute tubular necrosis,ATN)三种类型,对于不同类型AKI的鉴别尤其对于结构性肾损伤ATN的鉴别仍是选择有效治疗方式及改善预后的重要因素,也是临床亟待解决的问题,因为ATN预后最差,严重的ATN需肾脏代替治疗,若在疾病早期错误的判断为PRA及HRS-AKI,可能错误的选择大量扩容或血管收缩剂的治疗,对ATN无效,容易错过治疗时机,造成不可逆的肾功能损伤,增加医疗负担提升死亡率,因此,早期鉴别ATN对于选择正确的治疗时机和措施十分重要.

然而,目前尚无鉴别肝硬化患者ATN的无创诊断方法,现有的无创手段是基于一些尿液生物标志物,包括尿钠浓度、尿白蛋白(Albumin)或尿钠排泄分数(FeNa)[3]等,准确性较低.在国际腹水俱乐部2015年指南(revised consensus recommendations of the International Club of Ascites,ICA2015)[4]中,AKI仍然是根据血清肌酐的变化来诊断的.然而,血清肌酐受非肾脏因素的影响,更不能确定肝硬化AKI的病因,ICA2015指南提出有望探索一些新的生物标记物来解决上述问题.先前的实验研究证实,尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)在鉴别ATN与其他类型AKI中起重要作用[5],肾损伤因子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和三叶因子3(trefoil factor 3,TFF3)已被美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局定为高度敏感和特异性的尿液生物标志物,在临床前研究和临床试验中监测药物性肾损伤[6],既往研究表明尿KIM-1和TFF3在肝硬化合并AKI患者中ATN的识别中起重要作用[7],但报道较少.本研究旨在探讨尿液中NGAL、KIM-1、TFF3在肝硬化合并急性肾损伤患者急性肾小管坏死中的鉴别诊断价值.

以前对肝硬化AKI患者的这些生物标志物的研究只关注单一标志物的价值.但单一指标的敏感性和特异性较低,暂时无法进入临床应用.许多研究表明[8],两项或两项以上指标的联合检测可以提高诊断的敏感性和特异性.然而,指标联合对肝硬化患者ATN的诊断价值研究较少.本研究旨在探讨两种生物标志物的结合在ATN与其他类型AKI的鉴别诊断中的价值.报告内容如下.

1 材料和方法

1.1 材料 本试验纳入了2021-05/2023-01连续住院于天津市第三中心医院肝内科及天津医科大学第二医院的682例肝硬化患者,根据排除标准排除492例患者,其中因感染因素排除252例,其次慢性肾脏病的患者共69例,再次为无既往资料的62例,其他有恶性占位的36例,死亡的39例,其他原因34例,最终选取肝硬化失代偿期患者190例,包括108例AKI患者及82例非AKI患者,AKI患者中包括33例PRA,27例HRS-AKI及48例ATN.按照ICA2015指南[4]对肝硬化中AKI及PRA进行诊断,按照2019年提出的对于ICA2015的补充更新共识[9]确诊HRS-AKI,AKI的鉴别诊断和治疗依据指南的规范给予治疗,并个体化调整.ATN的诊断标准: 同前人研究[10],结合了临床及实验室数据,满足以下4个标准中的3个: (1)滤过钠排泄分数(fraction excretion of urine sodium,FeNa)＞2%,(2)尿渗透压＜400 mOsm/L,(3)尿钠＞40 mEq/L,(4)存在休克或使用肾毒性药物.

纳入标准: (1)入院的失代偿期肝硬化病人;(2)签知情同意书,通过伦理委员会的审核;(3)有3 mo内肌酐的基础资料;(4)年龄大于18岁.

排除标准: (1)有肝肾移植病史或透析治疗病史;(2)晚期慢性肾脏病(肌酐基础值≥4 mg/dL);(3)恶性肿瘤;(4)感染,括泌尿系统感染、原肺炎、自发性腹膜炎、肠道感染等;(5)消化性溃疡或炎症性肠病的患者.

1.2 方法 患者资料收集记录: 基础疾病、肝硬化病因、并发症情况、年龄、性别、肝肾功能、凝血常规、Child-Pugh评分,MELD评分等.详见表1.

表1 ATN组与其他类型AKI组间资料对比及生物标志物水平比较

标本采取与保存: AKI组患者在首次诊断为AKI后的24 h内及第3天,非AKI组在入院后的24 h内健康体检者在体检当天,取晨尿10 mL,标本离心10 min(1000 rpm),上清液在-80 ℃冰箱保存.

标本的检测: AKI组用发生AKI后第3天的尿标本检测NGAL,用发生AKI后24 h内尿标本检测TFF3及KIM-1,NGAL的利用乳胶增强免疫透射比浊法在天津市第三中心医院及天津医科大学第二医院检验科生化室于8200全自动生化分析仪上进行测定.采用ELISA法(R&D Systems,Minneapolis,USA)在天津医科大学第二医院临床检验科免疫科检测尿液中的KIM-1和TFF3.

统计学处理所用数据通过SPSS 2.0分析.满足或接近正态分布的计量用平均数±标准差(mean±SD)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,非正态分布计量用中位数及四分位数表示,两组间比较采用Wilcoxon秩和检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验,分类变量以例(%)表示,组间用卡方检验χ2比较,显著性用aP＜0.05或bP＜0.001(P＞0.05不注).如同一表中另有一套P值,则用cP＜0.05和dP＜0.001;第三套为eP＜0.05和fP＜0.001等;第四套为gP＜0.05和hP＜0.001等;用受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线探究诊断效能、诊断截断值,曲线下面积(area under the curve,AUC)值越接近1,诊断价值越高.

2 结果

2.1 ATN组与其他类型AKI组间基本资料及生物标志物水平比较 ATN组与其他类型AKI组患者的年龄平均值、男性比率、基础疾病情况、肝硬化病因情况在两组间差异无统计学意义,ATN组有较差的生化(肝肾功)指标,腹水发生率明显高于其他类型AKI组.通过Wilcoxon检验发现尿NGAL、尿KIM-1及尿TFF3在ATN组均高于其他类型AKI组,两组间差异均具有统计学意义.详见表1.

2.2 不同类型AKI组间生物标志物水平比较 本试验进一步分析不同病因AKI患者中生物标志物表达的情况,并与未发生AKI的肝硬化患者(非AKI组)及健康体检者进行比较,通过Kruskal-Wallis秩和检验发现,尿NGAL、尿TFF3及尿KIM-1在健康体检者及非AKI组中无表达差异,尿NGAL和尿TFF3在任何类型AKI组中浓度均明显大于非AKI组,差异均有统计学意义,但尿KIM-1在PRA及HRS-AKI组患者中表达水平与非AKI组相比,差异无统计学意义.进一步通过两两成对比较发现,3个指标在HRS组与PRA组表达差异均无统计学意义,且部分数值存在重叠,而两个指标在ATN组中数值明显大于PRA组及HRS组,差异均有统计学意义,详见表2.

表2 不同类AKI组间生物标志物水平比较

2.3 生物标志物对于ATN的诊断价值 本试验进一步利用ROC曲线评估生物指标对于肝硬化合并AKI患者中ATN的诊断价值,探究其诊断截断值,并与及临床现有的常有的评估肾功能指标(FeNa及尿Albumin)进行对比,3个指标的总体诊断效能均高于FeNa及尿Albumin,诊断价值最高的是尿NGAL,AUC是0.902,诊断临界值为271.80 ug/g Cr时,敏感度为81.3%,特异性为85.0%.其次,指标组合可提高鉴别诊断能力,其中尿NGAL联合尿TFF3的诊断能力最强(AUC=0.933),其次是uNGAL联合uKIM-1(AUC=0.918),均高于FeNa%及尿白蛋白,详见表3,ROC曲线图见图1.

图1 生物标志物的ROC曲线图.尿NGAL: 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,AUC: 曲线下面积=0.902;尿KIM-1: 肾损伤因子-1,AUC=0.821;尿TFF3: 三叶因子3,AUC=0.807;尿NGAL+尿KIM-1,AUC=0.918;尿NGAL+尿TFF3,AUC=0.933;尿KIM-1+尿TFF3,AUC=0.810;尿白蛋白,AUC=0.756;尿钠排泄分数,AUC=0.708.ROC曲线: 受试者工作特征曲线;NGAL: 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白;KIM-1: 肾损伤因子-1;TFF3: 三叶因子3;AUC: 曲线下面积.

表3 诊断ATN的ROC曲线

3 讨论

AKI是失代偿期肝硬化及慢加急性肝衰竭的常见并发症,常提示死亡率高且临床预后差,及时准确地鉴别AKI的类型,对于指导治疗及改善预后十分重要,尤其是如何早期识别结构性肾损伤ATN仍然是临床亟待解决的问题,目前还没有一种广泛应用的无创诊断手段可以单独实现,前期研究显示,尿NGAL对于鉴别ATN有一定的临床价值,但其诊断临界值仍需经过更多研究的验证,且其诊断效能有限,不能作为诊断ATN 的金标准,如何进一步提高尿NGAL的临床诊断效能对于疾病的治疗有重大意义.本研究发现,尿NGAL对于ATN的诊断效能卓越,AUC为0.902.截止值为271.8 ug/g Cr时,敏感性为0.813,特异性为0.85.试验还显示,其他指标如尿TFF3和尿KIM-1对ATN也具有较高的鉴别诊断价值,令人兴奋的是其中指标组合可提高鉴别诊断能力,其中尿NGAL联合尿TFF3的诊断能力最强(AUC=0.933,敏感性为0.854,特异度为0.883).

Gambino和Piano等[11]2022年在意大利的单中心研究中证实尿NGAL可以区分ATN(1162 ng/mL)和非ATN(PRA、HRS-AKI和混合型AKI依次为87、111和109 ng/mL),P＜0.001),诊断最佳截断点为220 ng/mL(AUC=0.854,灵敏度为89%,特异性为78%).另外两项单中心研究也得出了类似的结果,分别为Huelin[10]等人2019年在西班牙巴塞罗那对320名肝硬化合并AKI患者的研究,研究证实发生AKI第3天的尿NGAL对ATN的鉴别诊断效能最佳,诊断阈值为220 µg/g Cr [AUC=0.87,(95%CI:0.78-0.95)].另一项研究为2021年Allegretti等人[12]在马萨诸塞州波士顿的研究,研究显示尿NGAL对ATN的诊断临界值为244 ug/g Cr[AUC=0.762,(95%CI: 0.682-0.842)].本试验也表明尿NGAL区分ATN与其他类型的AKI(包括PRA和HRS-AKI)的能力优异,临界值在271.8 ug/g Cr时,AUC为0.902,敏感性为0.813,特异性为0.85,与近期的类似研究结果相比非常相似甚至诊断效能更佳,结果优于以往的研究,可能是由于总结了前人研究的经验及教训,将尿NGAL用尿肌酐矫正后进行验证,且选取了发生AKI后的第3天的尿标本进行试验,同时排除了感染在试验中的干扰[13],此外,试验结果的不同可能与人群不同、样本量过小、检测方法不同相关,但总而言之,不同国家、人群及不同检测方法得出试验结果的一致性表明,NGAL在不同国家和不同肝硬化人群中对于ATN具有良好和可靠的诊断性能[14].

KIM-1是一种跨膜蛋白,在正常肾组织中几乎不表达,但在肾小管损伤时在近曲小管内皮细胞中明显表达,前期研究证实其作为AKI早期诊断的新型生物标志物具有明显的优势[15],而且KIM-1有很强的特异性,在身体其他器官中很少表达,同时又具有很高的稳定性,使其易于在尿液中检测到,因此其在肾脏中潜在的临床价值值得进一步探究[16],既往研究显示,尿KIM-1在ATN的识别中起重要作用,Belcher等[17]研究了尿KIM-1对于肝硬化合并AKI中ATN的有一定的鉴别作用,AUC=0.639,Ariza等[18]研究发现尿KIM-1在肝硬化合并AKI患者中的ATN的有一定鉴别诊断作用,AUC为0.704,敏感性为67%,特异度为74%.本试验中发现尿KIM-1对于ATN的鉴别诊断作用不容忽视,AUC=0.821,敏感性及特异度均大于80%,有潜在的临床价值,值得进一步研究.

自TFF3被发现以来,其在临床中可能发挥的作用一直是研究者关注的焦点之一,大量临床研究结果表明,TFF3在肿瘤的发生及发展中发挥重要意义[19],随着人们对TFF3生物学效应的关注,其在肾脏学领域的应用得到的关注越来越广泛[20,21],前期研究表明[18],TFF3在肝硬化合并AKI中对于ATN有较好的诊断效能,AUC=0.824,敏感度为75%,特异性为81%,截断点为3040 ug/g Cr.但相关的研究较少,其升高机制不仅与与肾小管损伤相关,更可能与炎症及肾小管修复再生相关[21],与NGAL及KIM-1的升高机制不尽相同,值得临床进一步探究.本研究中,尿TFF3对于肝硬化合并AKI患者中ATN的鉴别诊断有一定价值,AUC=0.807,特异度为85.0%,敏感度为79.2%.TFF3可能成为AKI新的生物标志物,其应用及作用机制仍需在多中心前瞻性临床研究中进一步探索.

考虑到单一实验室生物标志物的诊断效果有限,仍不能作为临床鉴别ATN的金标准,既往研究显示[17],多项指标的联合能提高对于肝硬化合并AKI中ATN的诊断的准确性,且考虑到临床医生的检查习惯及医疗成本,本研究联合两项指标分析对ATN患者的诊断价值.本试验结果显示,两项指标联合能进一步提高单个指标对于肝硬化患者中ATN的诊断效能,其中尿NGAL+尿TFF3诊断效能最高,AUC为0.933,敏感度为85.4%,特异度为88.3%,明显提升了单个指标的诊断效能,其原因可能为两项指标的升高机制不同,不同机制的指标间联合可进一步提升诊断效能,但需更多研究的验证,且TFF3与肾小管上皮细胞修复相关[22],其最佳的检测时限需进一步探究总之,TFF3在肝硬化合并AKI患者中的作用值得进一步研究.

本实验的创新之处在于: 采用不同指标的联合检测进行联合检测,不同于以往研究中单纯血液或尿液中指标的检测,进一步提升现在指标的诊断效能.本实验的局限性在于样本量过小,且以血清肌酐等现有临床指标作为参考和诊断标准导致统计结果存在偏差.

近年来,新型肾脏标志物在肝硬化合并AKI患者的诊断、鉴别诊断、预后及治疗应答预测方面显示出广阔的前景.大量研究证实,尿NGAL、尿KIM-1及尿TFF3等生物标志物能有效区分肝硬化人群中ATN与其他类型AKI,其中尿NGAL研究最多且证实能进入临床应用的希望最大,但尽管取得了一些成果,仍需多中心、大样本的临床试验,此外,两项指标或多项指标联合检测对于肝硬化人群中ATN鉴别诊断的潜在价值不容忽视,有待进一步研究.总之,新的肾脏生物标志物有望成为肝硬化患者中对于不同类型AKI,尤其对于结构性肾损伤的鉴别手段,对于改善疾病预后及节约医疗成本有望起到重要作用.

4 结论

文章亮点

实验背景

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是失代偿期肝硬化常见的并发症,预后较差且死亡率高,临床上早期识别结构性肾损伤急性肾小管坏死(acute tubular necrosis,ATN)对于治疗方案的选择及改善预后十分重要,前期研究显示,尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)对于鉴别ATN有良好的效能,但其诊断临界值仍需经过更多研究的验证,此外,三叶因子3(trefoil factor 3,TFF3)及肾损伤因子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)是近年来在肝硬化合并AKI中较为关注的生物标志物,对于ATN与其他类型的AKI也有潜在的鉴别诊断价值,本试验进一步探究上述生物标志物及两项指标联合检测在肝硬化合并AKI患者中对于ATN的鉴别诊断效能.

实验动机

本试验在多项国内外研究的基础上,探讨NGAL、TFF3、KIM-1及指标间两两联合检测成为早期鉴别肝硬化合并AKI患者中ATN生物标志物.

实验目标

探讨NGAL、KIM-1、TFF3及2项指标间联合检测在肝硬化合并AKI患者中对于ATN的鉴别诊断价值,为临床的早期诊断及治疗探究新型指标,改善患者预后.

实验方法

试验于4月16日整地覆膜，4月23日播种，6月10日膜上覆土种植的小区开始覆土，采用人工覆土，覆土厚度3 cm，6月25日露地种植的小区开始中耕培土，结合培土追肥1次，7月20日（现蕾期）对每个小区喷施马铃薯专用液肥，并结合喷施烯酰锰锌800倍液防治晚疫病，7月28日在保护行发现晚疫病中心病株3株，主要感染茎叶，做拔除处理，小区内未发现病株，并于7月29日喷施霜脲锰锌防治晚疫病，晚疫病得到有效控制。8月12日，（盛花期）对每个小区喷施马铃薯专用液肥，并喷施甲霜灵防治晚疫病。

选取失代偿期肝硬化患者190例,其中合并AKI患者108例,根据AKI病因分成不同亚组,包括33例肾前性氮质血症,27例肝肾综合征急性肾损伤型及48例ATN,探讨血尿NGAL、TFF3、KIM-1及指标间联合检测对于ATN的鉴别作用.

实验结果

尿NGAL对于肝硬化合并AKI患者中ATN的鉴别诊断价值较高,受试者工作曲线下面积(area under the curve,AUC)是0.902,诊断临界值为271.8 ng/mL时,敏感度为81.3%,特异性为85.0%.指标组合可提高鉴别诊断能力,其中尿NGAL联合尿TFF3的诊断能力最强(AUC=0.933,敏感度为85.4%,特异性为88.3%).

实验结论

本试验发现NGAL对于鉴别肝硬化合并AKI患者中ATN与其他类型AKI也有重要价值,且指标间联合检测可提高诊断能力,为临床的诊治提供新的思路.

展望前景

本试验的为单中心研究,样本量偏小,且以血肌酐而非肾脏穿刺作为AKI的诊断标准,存在与实际情况相悖的可能,存在明显局限性,未来需进一步增加样本量,多中心研究,探究生物标志物及指标间联合在临床中的应用价值.