替硝唑对牙龈卟啉单胞菌参与的鼠食管鳞癌的影响及机制

曲智锋,徐 远,原 翔,娄朝暄

(河南科技大学第一附属医院 1. 放疗科、2.PICC门诊、3. 肿瘤表观遗传重点实验室、4. 药剂科,河南 洛阳 471003)

食管癌是目前临床上非常常见的消化系统恶性肿瘤之一,死亡率极高,在我国,食管鳞状细胞癌仍然是食管癌主要的组织学类型[1]。临床上对该病的治疗手段主要是以放化疗为主,不过其整体预后不佳,研究认为口腔卫生不良和牙周炎等与胃肠道肿瘤疾病有一定的联系。研究曾指出牙龈卟啉单胞菌就是牙周疾病的关键致病菌之一[2]。所以需尽早明确有效的治疗药物。替硝唑是一类硝基咪唑类抗菌药物,用于各种厌氧菌感染,也用于结肠直肠手术、妇产科手术及口腔手术等的术前预防用药[3]。此外,IL-6/STAT3信号通路在炎症反应调节中发挥重要作用,其可参与炎症性疾病和恶性肿瘤等病变的发生,认为IL-6/STAT3介导的信号通路与食管癌的发生、发展和转移关系密切,并影响食管癌的预后[4]。但是目前并未有研究针对替硝唑对牙龈卟啉单胞菌参与的食管鳞癌的影响进行过分析,其具体机制也不明确,因此,本研究以食管癌模型小鼠为研究对象,分析替硝唑对其的影响及机制,为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物于与分组 选取50只C57BL/6雄性小鼠为研究对象,购自常州卡文斯实验动物有限公司,将其随机分为对照组、模型组、替硝唑低、中、高剂量组,每组各10只。

1.1.2仪器与试剂 替硝唑片(中国山西津华晖星制药有限公司,国药准字H20023791)、乌拉坦溶液(国药集团化学试剂有限公司,批号20120125)、PBS缓冲液(武汉普诺赛生命科技有限公司,批号WH0321E111)、石蜡(solarbio公司,批号YA0013)、BCA 蛋白浓度检测试剂盒、ELISA、反转录试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号E-BC-K318-M、DTA00D、BK50)、离心机、凝胶成像仪(上海无陌光学仪器有限公司,批号20163854、180524)、PCR仪、电泳仪(美国Bio-Rad公司,批号A51685、1658000)、组织匀浆机(深圳欣博盛生物科技有限公司,批号B297805)、兔抗鼠IL-6抗体、STAT3单克隆抗体、p-STAT3单克隆抗体(美国Abcam公司,批号ab233706、10000862、ab267373)。

1.2 方法

1.2.1模型制备及给药 除对照组外,其余小鼠采用20%乌拉坦溶液,按小鼠体质量6 μL·g-1进行给药,于显微镜下分别对小鼠左右上颌第二磨牙进行丝线结扎。取牙龈卟啉单胞菌以2 000 r·min-1离心10 min,2%羧甲基纤维素溶解牙龈卟啉单胞菌,浓度为2×1013L-1,取菌液50 μL涂抹于小鼠上颌磨牙区,隔天涂抹,连续2周。对照组和模型组不做处理,成模4周后,采用灌胃方式给药处理并持续8周,替硝唑低、中、高剂量组分别采用15、10 、25 mg·kg-1的替硝唑进行处理。

1.2.2记录小鼠体质量 给药结束后对各组小鼠进行称体质量、记录。

1.2.3HE染色观察小鼠病理变化 先麻醉小鼠,平躺固定,开腹后用生理盐水充分冲洗,固定后酒精脱水,将组织块放入溶于酒精和石蜡的透明剂中,放入培养箱中。石蜡完全浸入组织块后,连续5 μm切片,进行染色,然后观察各组小鼠食管组织的病理学变化。

1.2.4ELISA检测各组小鼠血清炎性细胞因子 采用小鼠眼球取血方法采集血液,离心后置于-80 ℃环境中待检,采用ELISA法检测小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,严格按照说明书操作。

1.2.5Western blot检测IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达 收集组织匀浆后提取总蛋白,RIPA缓冲液裂解,冰上孵育后12 000 r·min-1离心5 min,取上清测定总蛋白浓度后。进行定量,然后灌胶,加足够电泳液进行上样,再进行电泳、转膜,将膜用TBS浸湿后摇动封闭1 h,加IL-6、STAT3、p-STAT3抗体(1 ∶1 000)、4 ℃孵育过夜后加入二抗(1 ∶3 000) ,37 ℃放置30 min,TBST洗涤3遍后进行化学发光检测,然后浸入显影液中显色、最后凝胶成像,使用β-actin作为内参。

1.2.6PCR检测IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表达 提取组织于无酶匀浆器中、加入TRIzol试剂提取总RNA,按逆转录试剂盒说明书要求,将提取的总RNA反转录成cDNA,然后再进行扩增,以β-actin为内参,检测相对表达:ΔCt =目的基因Ct-内参基因Ct,引物序列见Tab 1。

2 结果

2.1 替硝唑可改善牙龈卟啉单胞菌参与的鼠食管鳞癌模型体质量与对照组相比,模型组组小鼠体质量较低,与模型组相比,替硝唑各剂量组小鼠体质量较高,P<0.05,见Tab 2。

Tab 1 Primer sequences

Tab 2 Comparison of body mass of

2.2 替硝唑可改善牙龈卟啉单胞菌参与的鼠食管鳞癌模型食管病理变化对照组上皮完整,基底细胞大小均匀,排列整齐,未见明显细胞增殖;模型组食管黏膜上皮增厚,基底细胞呈弥漫性增生;基底细胞表现为局灶性非典型增生,细胞层增多,排列紊乱,极性消失,黏膜表面角化层局灶性缺失;而替硝唑各剂量组均呈现出不同程度的改善。

2.3 替硝唑可改善牙龈卟啉单胞菌参与的鼠食管鳞癌模型血清炎症因子与对照组相比,模型组组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平较高,与模型组相比,替硝唑各剂量组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平较低,P<0.05,见Tab 3。

Tab 3 Comparison of inflammatory factor levels among

2.4 替硝唑可改善牙龈卟啉单胞菌参与的鼠食管鳞癌模型组织IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表达各组IL-6表达比较差异无统计学意义,P>0.05,与对照组相比,模型组小鼠STAT3、p-STAT3蛋白表达较高,与模型组相比,替硝唑各剂量组小鼠血清STAT3、p-STAT3蛋白表达较低(P<0.05),见Tab 4、Fig 2。

Fig 2 Comparison of IL-6,STAT3 and p-STAT3

Tab 4 Comparison of IL-6,STAT3 and p-STAT3 proteins among

2.5 替硝唑可改善牙龈卟啉单胞菌参与的鼠食管鳞癌模型组织IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表达与对照组相比,模型组小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表达较高,与模型组相比,替硝唑各剂量组小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表达较低(P<0.05),见Tab 5。

Tab 5 Comparison of IL-6,STAT3 and p-STAT3 mRNA in each group of

3 讨论

食管鳞癌是以淋巴转移为主要特征的疾病,流行病学研究发现炎症是肿瘤的重要特征之一[5]。目前许多研究均发现,牙龈卟啉单胞菌可能是食管鳞癌的危险因素,其在口腔、食管癌组织中均有检出[6]。其次,替硝唑作为一类硝基咪唑类药物,研究曾指出替硝唑的药理机制是抑制致病菌的DNA合成,从而可以消除牙周组织中的细菌,抑制局部炎症反应[7]。因此,本研究主要分析替硝唑对牙龈卟啉单胞菌参与的食管鳞癌小鼠的影响及机制。

在本研究中,首先对小鼠的体质量进行了观察,结果显示,替硝唑各剂量组小鼠体质量更高。这说明替硝唑对牙龈卟啉单胞菌造成的食管鳞癌病变小鼠有一定的干预效果。其次,本研究还针对小鼠食管组织进行了病理学观察,结果发现,与对照组相比,模型组小鼠食管黏膜上皮较厚,基底细胞出现弥漫性增生,基底细胞也出现了不典型增生,细胞排列十分杂乱,而替硝唑各剂量组均呈现出不同程度的改善。这表明,替硝唑可改善食管鳞癌小鼠的病理学变化。而牙龈卟啉单胞菌就属于会在人体内会黏附和入侵宿主细胞,促进牙菌斑生物膜形成,并引起宿主免疫炎症反应的细菌[8]。因此,本研究对小鼠血清炎症因子进行了检测,结果显示替硝唑各组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平有所改善,这说明替硝唑可以改善牙龈卟啉单胞菌造成的食管鳞癌小鼠模型炎症反应。

IL-6/STAT3通路与肿瘤的发生发展密切相关。一般来说,IL-6的生物活性依赖于STAT3的激活,而STAT3通常以非激活的形式存在于细胞质中[9]。曾有研究[10]认为,STAT3抑制剂可以明显抑制食管鳞癌来源的裸鼠皮下荷瘤生长。因此,本研究对小鼠组织IL-6/STAT3通路相关蛋白及基因表达进行了检测,结果表明:与对照组相比,模型组小鼠STAT3、p-STAT3蛋白表达较高,与模型组相比,替硝唑各剂量组小鼠血清STAT3、p-STAT3蛋白表达较低;而IL-6蛋白水平通常不表达,在本研究中也证明了这一点。此外,与对照组相比,模型组小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3基因表达较高,与模型组相比,替硝唑各剂量组小鼠血清IL-6、STAT3、p-STAT3基因表达较低。这说明替硝唑在食管癌中有潜在的治疗价值。食管鳞癌患者口腔唾液中牙龈卟啉单胞菌较高,而替硝唑是新型抗厌氧菌药物的一种,本研究分析替硝唑或许可以通过IL-6/STAT3通路对牙龈卟啉单胞菌造成牙周炎而导致的食管损伤有一定的保护作用。

综上所述,牙龈卟啉单胞菌造成牙周炎会促进食管鳞癌病变和进展,替硝唑可以改善牙龈卟啉单胞菌造成食管鳞癌模型的病理学变化以及炎症反应,其机制与IL-6/STAT3信号通路有关,但该过程涉及的通路较多,有待后续进一步深入探究。