黄连-肉桂配比对慢性心力衰竭大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响

何 霞,卿媛媛,常嘉昱,钟思凡,朱筱婧,张 婷,庄 红,颜 旭

(1.湖南中医药大学研究生院,湖南 长沙 410208;2.湖南省中医药研究院附属医院,湖南 长沙 410006)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是心脏结构或功能异常导致射血功能下降,无法将静脉回流的血液排出心脏,动脉血液供应不足的疾病[1]。CHF是以呼吸困难、机体活动受限、液体滞留为特征的临床综合征[2]。下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴是神经内分泌系统的重要组成部分,参与调控机体应激及全身多个系统[3-4]。HPA轴失常可引起焦虑、抑郁、失眠、阿尔茨海默病、肠应激综合征等[5-8]。心衰患者体内HPA轴呈慢性持续性激活状态,随着病情进展,体内肾上腺皮质酮(Corticosterone,CORT)的峰值升高,其分泌主要由垂体产生的促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)调节,而促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)能够增加ACTH分泌。胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)是CHF发病机制之一,当 IR 合并心力衰竭时,心肌葡萄糖代谢减少,心功能受损,因此改善IR与心功能并举至关重要[9]。当IR时氧化依赖葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)表达量下降,引起心肌能量代谢异常,导致心衰发生[10-11]。交泰丸由黄连、肉桂按质量比10∶1组成的经典方药。以往研究显示,黄连-肉桂配伍可调控、改善IR,本课题组以黄连-肉桂为基础组方的强心安神方经实验观察可调控多种通路,改善心衰[12-15]。本次研究通过检测HPA 轴的激素水平及心肌 GLUT4 蛋白表达,观察黄连-肉桂不同配比对CHF大鼠作用,阐明其改善心衰大鼠心功能的作用机制,为治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SD 健康雄性大鼠60只,清洁SPF 级,体重 200～280 g,于湖南斯莱克景达实验动物有限公司采购[批号SCXK(湘) 2019-0004],实验许可证号[SYXK(赣)2020-0001]。

1.1.2 主要药物与试剂:中药饮片黄连、肉桂均购于湖南省中医药研究院附属医院。盐酸阿霉素注射液(批号S17092);大鼠NT-proBNP、CORT、CRH、ACTH试剂盒(批号MM-0329R1、MM-0559R1、MM-0520R1、MM-0565R1);GADPH内参一抗(批号HC201);GLUT4一抗(批号AF5386);RIPA细胞裂解液(批号C1053);BCA蛋白定量试剂盒(批号E-BC-K318-M);十二烷基硫酸钠(批号151-21-3);甘氨酸(批号G8200)。

1.1.3 实验仪器:移液枪(型号5-50μl)、全自动酶标仪(型号WD-2012B)、电热恒温培养箱(型号DHP-9082B)、高速冷冻离心机(型号TGL-16.5M)、组织脱水机(型号KD-TS3S1)、包埋机(型号HistoCore Arcadia)、切片机(型号HistoCore BIOCUT)、蛋白垂直电泳仪(型号DYY-6C)、超高灵敏度化学发光成像系统(型号Chemi Doc TMXRS+)、全自动化学发光图像分析系统(型号Tanon-5200)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、造模与模型鉴定:在SD雄性大鼠60只中,随机取6只作为空白组,余54只造模处理。造模期间大鼠死亡14只,且4只精神欠佳亦舍去,剩余36只大鼠在灌胃期间死亡12只。最终各组均6只分成模型组、黄连组(黄连15 g、肉桂1.5 g)、肉桂组(黄连1.5 g、肉桂15 g)、黄连-肉桂组(黄连、肉桂各6 g)。除正常组6只大鼠外,其余组均腹腔注射1 mg/ml盐酸阿霉素溶液,按1.25 mg/kg剂量腹腔注射,正常组注射等量0.9%氯化钠溶液,每周2次,总共注射7次,总量8.75 mg/kg。观察大鼠精神状态、活动情况、饮食、体重、呼吸频率等日常生活习惯情况,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP),应用心脏彩超检测心功能,通过上述方法判断慢性心力衰竭大鼠造模情况。

1.2.2 干预方法与取材:按照上述分组进行药物处理,按比例配伍饮片。将29.7 mg/kg的饮片煎熬浓缩成等体积容量灌胃,空白组、模型组予同体积灭菌蒸馏水灌胃,各组灌胃1次/d,持续4周。于末次给药第2日早上取材,水合氯醛麻醉,后腹主动脉采血5 ml以上,离心,取上清,放冰箱备用;剪开肋骨,暴露胸腔,剪断血管,剥离心脏,用0.9%氯化钠溶液洗去残留血液,分离心尖、左心室。ELISA法检测血清ACTH、CORT、CRH水平;Western blotting法检测心肌GLUT4蛋白。

1.2.3 心脏彩超检测大鼠心功能:大鼠麻醉后应用小动物超声系统检测左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室轴缩短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS)。

1.2.4 HE染色检测心肌组织形态:大鼠腹主动脉取血后迅速解剖心脏组织,洗去残留血液,切取心尖组织,放置于4%多聚甲醛固定48 h,石蜡包埋,切片、烤片,苏木素水溶液染色5 min,流水冲洗15 min,梯度乙醇各脱水10 min;伊红染色1～2 min,乙醇脱水,将玻片置于二甲苯中透明2次,3 min/次,中性树胶封片,放入65 ℃烘箱15 min,光学显微镜下观察组织形态。

1.2.5 ELISA 法检测大鼠血清NT-proBNP、ACTH、CORT、CRH水平:大鼠麻醉后腹主动脉采血5 ml,3000 r/min离心,15 min后,保留上清液,运用 ELISA 法测定各组蛋白含量,严格按说明书操作。

1.2.6 Western blotting法检测大鼠心肌组织GLUT4蛋白表达:取大鼠心肌组织,提取总蛋白,凝胶电泳分离蛋白后使用BCA法测定蛋白浓度,半干式转法将蛋白转移至PVDF膜上,封闭后加一抗稀释液,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,5 min/次;二抗稀释,室温孵育,TBST洗膜3次,5 min/次,配制ECL发光液进行显色检测,Image J软件读取灰度值。

2 结 果

2.1 造模后各组大鼠状态比较 空白组大鼠精神状态良好,体重处于正常范围,正常活动,呼吸脉搏次数无明显变化,进食正常,二便正常。模型组、肉桂组和黄连-肉桂组大鼠精神状态差,存在腹水,毛色干枯变黄,活动明显减少,呼吸脉搏频率增快,二便减少。黄连组大鼠精神一般,不喜活动,身体蜷缩,进食较少,二便稍减。

2.2 各组大鼠LVEF、LVFS、NT-proBNP水平比较 见表1。与空白组比较,模型组、黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组的LVEF、LVFS 均低,差异有统计学意义(P<0.01)。药物干预后,黄连-肉桂组NT-proBNP 值低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠LVEF、LVFS、NT-proBNP蛋白比较

2.3 各组大鼠心肌组织病理形态比较 见图1。空白组心肌细胞形态排列致密,细胞结构完整,无明显炎性浸润现象。模型组心肌组织结构重度异常,心肌细胞广泛排列紊乱,细胞轮廓不清晰,间隙增大,可见部分细胞空泡变性,如黑色箭头所示。黄连-肉桂组、肉桂组心肌组织结构中度异常,部分区域心肌细胞排列紊乱,间隙增大,细胞轮廓不清晰,可见空泡变性,如红色箭头所示;间质可见少量纤维组织增生,如黄色箭头所示;炎症细胞浸润,如黑色箭头所示。黄连组心肌组织结构基本正常,细胞排列较为紧密,偶见细胞水肿,胞浆疏松空泡化,如黑色箭头所示;组织未见明显炎症细胞浸润。

图1 各组大鼠心肌病理形态比较(HE染色,×400)

2.4 各组大鼠CRH、ACTH、CORT蛋白表达比较 见表2。给药结束后,模型组心衰大鼠 CRH、ACTH、CORT表达均高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组大鼠ACTH、CORT表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠CRH、ACTH、CORT蛋白表达比较(ng/ml)

2.5 各组大鼠心肌组织中GLUT4蛋白表达比较 见表3(图2)。给药结束后,模型组心衰大鼠 GLUT4蛋白表达低于空白组,差异有统计学意义(P<0.01)。黄连组、肉桂组、黄连-肉桂组大鼠GLUT4蛋白表达均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 各组大鼠心肌组织GLUT4蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠心肌组织中GLUT4蛋白表达比较

3 讨 论

中医学对“心衰”的最早描述是西晋医家王叔和的《脉经》:“心衰则伏,肝微则沉,故令脉伏而沉”[16]。历代医家根据心衰症状诊断为“心水”“痰饮”“喘证”“水肿”等[17]。中医药可缓解心衰症状、改善心功能、预后。本课题组在多年临床实践中发现,心衰病位在心、肾,心主血,肾主水,心火推动血脉运行,肾主全身水液代谢,心衰时心火亢盛,邪气亢进,肾水难以制约心火,心肾水火失调,故从心肾水火相关性论治心衰。《韩氏医通》中记载:“黄连为君,佐官桂少许,煎百沸,入蜜,空心服,能使心肾交于顷刻”是黄连-肉桂最经典配伍的出处,此配比为交泰丸,是“交通心肾”“水火共济”治法的代表方。本课题组前期临床研究证实,以黄连、肉桂为基础的“强心安神方”可改善心衰症状,调控多条通路,改善阿霉素致心衰大鼠的心功能[13-15]。

慢性心力衰竭的病理机制错综复杂,主要涉及氧化应激、心室重构、神经内分泌细胞因子系统的过度激活等[18]。研究表明,HPA轴与心力衰竭密切相关,心衰患者HPA轴处于慢性持续性激活状态,随着病情进展,体中CORT峰值进一步升高,CORT可调动血管及心脏的盐皮质激素受体(Mineralocorticoid receptor,MR),参与其病理过程,加重心衰程度[19]。HPA轴调节异常时皮质醇分泌增多,抑制HPA轴反馈能力降低,皮质醇进一步上升,中枢信号紊乱,导致高血压的发生[20]。HPA轴对人体调控与肾对人体调节作用一致,肾上腺皮质激素的生理功能相当于中医肾气或肾阳的功能。曹利华等[21]提出“肾通于脑”的现代生物学基础可能与HPA轴调控机制相关。中医“肾主水”理论认为,肾调控全身水液的输送、代谢,且应四时而调节,春夏季以蒸腾气化为核心,秋冬季以收藏为主,这与HPA 轴可能是肾阳发挥作用的物质基础有异曲同工之妙。肾为相火,与心交济,互为交感互藏。肾为相火,与心交济,互为交感互藏。心阳温煦为火主升,以降为顺,居上而属阳;肾主水藏精归水,主静,以升为和居下而属阴。一阴一阳之间,肾水滋润心阴而心火不亢,心火温煦肾阴使肾水不寒。本研究中,黄连性苦寒,可上清亢盛之心火,使心火下交肾水;肉桂辛甘大热,可助阳补火,引火归元,肾阴可上济心阳;二者合用则有泻南补北、交通心肾之功,使心肾水火阴阳相调。本研究中黄连、肉桂按不同比例配伍,探求药物配比对慢性心力衰竭大鼠的作用。与空白组比较,模型组大鼠ACTH、CORT、CRH含量上升,经过黄连、肉桂不同比例干预后ACTH、CORT含量下降,说明在心衰大鼠体内HPA轴处于激活状态,且黄连、肉桂配伍可抑制HPA轴应激,且以黄连组效果最佳,而对CRH调控无影响,考虑可能是黄连、肉桂组方只调控HPA轴下游,或是CORT负反馈调控HPA轴,使CRH上调。上述研究说明,交泰丸通过干预下丘脑-垂体-肾上腺轴治疗慢性心力衰竭,且黄连、肉桂抑制ACTH、CORT分泌,改善慢性心力衰竭大鼠心功能。

心肌葡萄糖的摄取和氧化依赖GLUT-4蛋白,出现IR时,激活胰岛素的蛋白通路受阻,GLUT4蛋白表达或易位减少,导致心肌摄取葡萄糖减少,引起心肌能量代谢异常,心功能受损,心衰发生[22]。IR会削弱心肌代偿力,激活交感神经系统,影响斑块稳定性,破坏凝血、纤溶系统平衡,钙信号通路异常等导致HF发生发展。因此,GLUT4蛋白表达可反映心肌胰岛素抵抗状态。本实验中,模型组大鼠 GLUT4蛋白表达下降,说明心衰时存在胰岛素抵抗;黄连、肉桂配伍干预后,大鼠GLUT4蛋白表达上升,说明其可上调GLUT4 蛋白表达,改善胰岛素抵抗,且比黄连组更有效。由此可见,心力衰竭与HPA轴功能调节失衡密切相关,黄连、肉桂配伍从整体上调控HPA轴功能,抑制胰岛素抵抗,改善大鼠慢性心力衰竭。

综上所述,黄连、肉桂配伍可改善心衰大鼠症状,降低大鼠血清NT-proBNP水平,保护心功能,调控HPA轴,改善胰岛素抵抗状态。