基于TLR4/BAFF/APRIL信号通路探讨肾炎止血丸对IgA肾病大鼠的作用机制

陈 明,闫晓明,王海艳,尚国旗, 李莲花, 程楚楚,陈 瑶,张佩青

(1黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036;2黑龙江省中医药科学院研究生·黑龙江 哈尔滨 150036)

IgA肾病(IgAN)是原发性肾小球疾病中最常见的一种,在我国占原发性肾小球疾病患者的39.6%～44.6%[1]。多以反复发作的肉眼血尿或镜下血尿为主要症状,病理表现为以IgA为主的免疫复合物沉积在肾小球系膜区,伴系膜增生等。20～25年30%～40% 的IgA肾病患者进展至终末期肾病(ESRD)[2]。IgAN发病机制可能与多重免疫打击有关,包括半乳糖缺陷型IgA1(Gd-IgA1)的形成,抗Gd-IgA1的自身抗体合成;循环免疫复合物形成,并在肾小球系膜中沉积,引发肾损伤,导致IgAN的发生和发展[3]。越来越多的证据证明黏膜受到细菌及病毒等感染导致B细胞活化因子(BAFF)及增殖诱导配体(APRIL)表达上调,其直接诱导产生更多Gd-IgA1;或通过Toll样受体(TLRs)和BAFF、APRIL信号传递引起IgA异常增多在IgAN的发生、进展中来发挥至关重要作用[4]。另外有证据表明BAFF可抑制核心1β1,3半乳糖基转移酶伴侣蛋白(Cosmc)表达,进而影响IgA1铰链区O-糖基化,最终形成大量Gd-IgA1[5]。

全国名中医张佩青教授认为IgAN病位在肺、脾、肾三脏,并以三脏三腑(肺-大肠、脾-胃、肾-膀胱)为病机核心,结合IgAN发病核心机制(黏膜免疫异常引起Gd-IgA1异常增多),提出“三脏三腑-黏膜轴”理论[6],以补益肺、脾、肾三脏,兼以清热凉血止血、活血化瘀为治则,拟方肾炎止血丸。前期研究已证实肾炎止血丸能改善IgAN患者临床症状,减少尿红细胞及尿蛋白,降低血肌酐及尿素氮,提高内生肌酐清除率,减少血IgA含量[7],减少IgA在肾小球系膜区的沉积[8],减轻肾损伤;降低白介素6(IL-6)、核因子κB(NF-κB)的表达[9-10]。本文通过动物实验基于TLR4介导BAFF/APRIL通路进一步探讨肾炎止血丸的作用机制,为肾炎止血丸治疗IgAN提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验药物 肾炎止血丸:黑龙江省中医医院制剂室提供,批号:170903,规格:0.04 g/粒,主要组成药味:黄芪、党参、熟地、茅根、侧柏叶、旱莲草、小蓟、地榆、蒲黄、赤芍、生地、大黄炭、阿胶。氯沙坦钾片(阳性对照):杭州默沙东制药有限公司,批号:H20000371,规格:50 mg/片。

1.2 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠48只,鼠龄8周,体质量(200±10)g,购自哈尔滨医科大学实验动物学部,动物许可证号:SCXK(黑)2019-001。微生物控制等级:一级。经黑龙江省中医药科学院实验动物管理委员会批准。

1.3 主要试剂 尿蛋白试剂盒:上海执诚生物技术有限公司;TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6 ELISA试剂盒:江苏酶免实业有限公司;苏木素-伊红染液: 国药集团化学试剂有限公司;苏木素染液:江苏艾迪生生物科技有限公司。IgA、C3荧光抗体:英国Abcam公司。

1.4 主要仪器 325型酶标仪:芬兰Labsystems Multiskan MS 公司;AU480全自动生化仪:贝克曼库尔特有限公司;CX-33光学显微镜:奥林巴斯株式会社;迈瑞BS400全自动生化分析仪:中国迈瑞医疗器械有限公司;NIKON ECLIPSE CI正置光学显微镜:日本尼康株式会社;NIKON DS-U3成像系统:日本尼康株式会社。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药 48 只大鼠完全随机分组法分为正常对照组、模型组、肾炎止血丸高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性(氯沙坦钾片)组,每组8 只。除正常对照组外,其余各组大鼠采取牛血清白蛋白(BSA)、皮下注射四氯化碳(CCl4)、静脉注射脂多糖(LPS)联合造模方法制备IgAN模型[11];从实验第1天开始以BSA 400 mg/kg(配成水溶液2 mL)隔日灌胃,持续6 周,蓖麻油0.5 mL+CCl40.1 mL皮下注射,每周1次,持续9 周,第6、8周LPS 0.05 mg尾静脉注射,造模时间为10周;正常对照组:隔日灌服0.1%稀盐酸配制酸化水,每次2 mL,持续6周;生理盐水0.6 mL皮下注射,每周1次,持续9周;于第6、8周0.2 mL生理盐水尾静脉注射。实验第10周末各组大鼠开始给药,肾炎止血丸高、中、低剂量组分别按3.6、1.8、0.9 g/(kg·d)灌胃,阳性组予氯沙坦钾(科索亚) 20 mg/(kg·d)灌胃,连续灌胃给药6 周;正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃。

2.2 观察指标及检测方法

2.2.1 尿红细胞计数、尿白蛋白检测 给药6周末收集各组大鼠24 h尿液(此期间禁食不禁水),离心后留取上清液;采用尿沉渣计数法检测尿红细胞个数,采用双缩脲比色法检测24 h尿蛋白定量。

2.2.2 血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6水平测定 末次给药后禁食不禁水12 h,用1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠,腹主动脉采血,3 000 r/min离心10 min,离心半径10 cm,留取血清;按试剂盒说明书步骤,采用ELISA法检测血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6含量。

2.2.3 肾组织病理变化观察 1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射,处死大鼠,取左肾组织,4%多聚甲醛固定,乙醇脱水、透明、浸蜡后,石蜡包埋并切片,HE、Masson、PAS染色,镜下观察肾小球、肾小管的形态、大小,肾小球内细胞数,系膜区有无免疫复合物沉积以及肾小管间质损害程度、纤维化程度,胶原纤维等并拍照。

2.2.4 肾组织IgA、C3表达检测 直接免疫荧光法。取右肾组织4%多聚甲醛固定,制备组织切片;滴加FITC标记的IgA、C3荧光抗体,4 ℃避光过夜;滴加抗荧光淬灭剂,中性树胶封片;在荧光显微镜下观察IgA、C3在肾组织的沉淀情况并拍摄。应用Image-pro plus 6.0软件分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)。

3 结果

3.1 肾炎止血丸对 IgAN大鼠血尿、蛋白尿的影响 见表1。

表1 各组大鼠尿红细胞计数、尿蛋白比较

3.2 肾炎止血丸对IgAN大鼠血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6的影响 见表2。

表2 各组大鼠血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6含量比较

3.3 肾炎止血丸对IgAN大鼠肾脏病理变化的影响 HE、Masson、PAS染色结果显示:正常组大鼠肾小球结构完整,囊腔大小正常,血管袢结构清晰;肾小管结构完整,未见明显水肿,近曲小管及远曲小管上皮细胞排列有序,刷状缘结构正常。模型组系膜中、重度细胞增生及基质增多,肾小球可见大量炎症细胞浸润;肾小球内可见个别中性粒细胞。低剂量组肾间质见少量炎细胞浸润;肾小球结构基本完整,血管袢结构清晰,肾小球囊腔大小正常,组织中未见明显出血。中剂量组肾小球结构基本完整,血管袢清晰,肾小球囊腔大小结构正常;肾小管未见明显水肿,近曲及远曲小管上皮细胞排列正常,刷状缘结构正常。高剂量组肾小球结构完整,肾小球囊腔大小正常。阳性组肾小球视野中见个别肾小管上皮细胞脱落;肾小球血管袢结构清晰,组织未见明显炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理变化(A.HE染色,×200;B.Masson染色,×200;C.PAS染色,×200)

3.4 肾炎止血丸对IgAN大鼠肾组织IgA、C3表达的影响 模型组可见IgA沿肾小球系膜区呈团块或颗粒状弥漫沉积,合并C3沉积,与IgA分布基本一致;肾炎止血丸低、中、高剂量组及阳性组IgA、C3少量沿肾小球系膜区团块及颗粒样沉积。IgA、C3的免疫荧光累积光密度值(IOD)见表3。

表3 各组大鼠肾组织IgA、C3表达的比较

4 讨论

目前IgAN发病机制虽然尚未完全清楚,但越来越多的证据提示Gd-IgA1是IgAN发生发展始发及驱动的关键因素。自20世纪70年代以来,人们就认识到IgAN与黏膜之间的联系。黏膜免疫系统感染引起 IgA异常分泌为 IgAN 的发生提供原动力[12]。临床中多见呼吸道、胃肠道或泌尿道等黏膜部位感染出现在IgAN发病前[13],在黏膜感染过程中多出现血尿、蛋白尿[14],由此可见黏膜免疫系统的失常可能是IgAN发病的关键因素。研究表明IgAN的发病与黏膜感染引发的树突状细胞活化,导致B细胞活化Gd-IgA1增加密切相关[15]。B细胞成熟的两个关键因子APRIL和BAFF在 IgAN中的作用也逐渐明确[16],抗原刺激后BAFF、APRIL上调,B细胞增殖,启动免疫球蛋白类别转换(CSR),刺激幼稚B细胞转化为分泌IgA或IgG的浆细胞[17]。也有证据表明在IgAN患者扁桃体生发中心存在BAFF、APRIL异常表达的B细胞[18-19]。体外培养也证实外源性APRIL刺激IgAN患者淋巴细胞产生更多Gd-IgA1,并伴随B细胞成熟抗原(BCMA)和跨膜蛋白活化物及亲环蛋白配体相互作用分子(TACI)表达上调[20]。

TLRs是特有识别入侵微生物的细胞因子之一,参与非特异性免疫的重要蛋白分子,促进IgA的类别转换,并作为BAFF受体的跨膜激活剂和钙调亲环素配体相互作用分子发挥作用[21]。研究表明,当黏膜屏障受到外源致病微生物侵犯损伤时,抗原触发TLRs,呈递细胞活化并释放炎症因子。包括白介素(IL-6和IL-10)、转化生长因子-β、BAFF、APRIL等触发B细胞形成Gd-IgA1[22-24]。也有研究发现炎症(TLR4、NF-κB)信号转导与BAFF介导的炎症介质表达密切相关[25-26]。也有一些特异性的细菌可通过细胞壁的脂多糖诱导TLR4进而使Cosmc甲基化水平升高进一步导致Gd-IgA1产生[27]。

全国名中医张佩青教授认为IgAN病因多因邪毒入侵、饮食不宜、禀赋不足,致正邪交争,邪盛正衰则肺、脾、肾三脏功能虚衰,肺气虚则卫气不固,脾虚则统摄失调,肾虚失于封藏,精血及精微物质下泄表现为血尿或蛋白尿;外邪(风热居多)侵袭、湿、毒、热内蕴,热伤血络而妄行,久病入络,血脉瘀阻,久必生虚热,虚实夹杂而迁延难愈。肾炎止血丸是张佩青教授以调补肾脏、固护气阴、扶正治本,兼以清热活血、祛邪治标为基本原则而成的经验方。

本研究结果证明了肾炎止血丸(高剂量组作用更加明显)能够降低Gd-IgA1的表达,其治疗IgAN的机制可能通过抑制TLR4、NF-κB、IL-6炎症通路减少B细胞关键因子(BAFF、APRIL)表达,进而上调Cosmc蛋白调控Gd-IgA1通路。肾炎止血丸能明显减少肾组织IgA、C3的沉积,减轻肾脏病理损伤,有效减少尿蛋白流失及尿红细胞计数。

综上所述,肾炎止血丸通过抑制TLR4/BAFF/APRIL通路减少Gd-IgA1生成,改善IgAN大鼠蛋白尿、血尿及肾组织病理损伤,从而延缓IgAN进展。