神经系统免疫病自身抗体检测方法学进展及在诊断中的应用

李 科,闫亚平

(陕西师范大学生命科学学院,西安 陕西 710119)

神经系统疾病种类繁多症状复杂一直困扰着临床,近几十年里,陆续发现的抗神经细胞自身抗体逐渐将一部分神经系统疾病解释清楚。这类疾病损伤范围广泛,从中枢神经系统到外周神经及神经肌肉接头,可引发各种神经精神性的病变表现,只有做到早诊断早治疗,才有缓解或治愈的可能。自身抗体检测阳性逐渐成为此类疾病诊断的重要证据,视神经脊髓炎谱系病(NMOSD)的AQP4抗体及自免性脑炎(AE)的NMDAR抗体是两个典型的例子[1, 2]。抗体的发现和诊断意义的确定大幅度推动了神经自免病领域的研究进展。抗体检测新技术也随之不断被开发出来,用于疾病诊断,新自身抗体的发现,以及治疗效果评估及预后判断。本文将对神经免疫病自身抗体检测的方法学进展及其在疾病诊断中的应用做一个介绍。

1 神经系统自身抗体

神经系统自身免疫性疾病是免疫分子或细胞攻击神经系统引起的疾病,有广泛的临床表现,包括感觉运动异常、认知意识障碍、行为或精神异常等。根据目前一些抗体与疾病的相关性研究,人们普遍认为自身抗体可视为神经系统自免病的分子标志物。根据抗原在神经细胞中的定位,可将自身抗体分为两类:一类是神经系统副肿瘤综合征(PNS)相关自身抗体,抗原位于细胞胞内(比如GAD抗体)或胞核内(比如Yo抗体),正常情况下抗体与抗原并无直接接触的机会,一般认为没有直接的致病性;一类是自免性脑炎相关自身抗体,抗原一般位于细胞或神经突触表面,通常是离子通道,受体等,有直接致病性的抗体一般属于这一类。神经系统自身抗体产生的原因尚不十分清楚。一般认为基于下面几种机制。

1.1 免疫检查点异常自身反应性B细胞逃避中枢和外周的耐受检查点,产生几个B细胞亚群分泌自身抗体,持续的生发中心反应和长寿命浆细胞则加剧了自身抗体的产生[3]。临床上使用CTLA4或PD1/PDL1检查点抑制剂进行肿瘤治疗时,会较为罕见的诱发神经系统自免病或使其加重,可能与药物诱导了自身抗体(多为抗Ma2, Hu, Yo, GABABR及NMDAR抗体)产生有关[4, 5]。

1.2 肿瘤相关抗体肿瘤组织上异常表达神经组织抗原蛋白,抗肿瘤免疫反应与之发生交叉反应产生自身抗体。抗NMDAR抗体脑炎伴有卵巢畸胎瘤时会异位表达NMDAR,并有致密的B细胞和T细胞浸润,表明免疫反应可能在肿瘤处发生[6]。

1.3 感染相关抗体水痘病毒、HHV6、及COVID-19等感染时病毒蛋白或细胞坏死释放蛋白异常产生自身抗体。单纯疱疹病毒性脑炎患者倾向于发展为抗NMDAR抗体脑炎[7],COVID-19感染者中抗胞内蛋白抗体阳性率明显增多[8, 9]。复杂情况下自身抗体可能是由多种原因产生的,组织器官移植后出现的移植物抗宿主病[10]会有罕见的中枢神经症状,像骨髓移植出现抗LGI1抗体自免脑炎[11],干细胞移植出现抗GABAAR抗体脑炎[12]。

胎儿体内也可检出经母婴传递(maternal-fetal transfer)来的自身抗体。妊娠中期IgG分子可经过胎盘进入胎儿体内,再经尚不完整的血脑屏障进入胎儿中枢引起病理反应,这些抗体的影响可以是长远的,有可能伴随子代一生[13, 14]。妊娠中的自身抗体即便未对母体产生影响,但仍有可能影响到胎儿发育,像synapsin-I(SYN1)抗体在妊娠母体的检出率可达13.3%,可进入胎儿体内并导致胎儿的器官结构发育异常和神经精神发育疾病等[15]。

抗细胞表面抗体可以直接接触神经细胞表面分子,致病机制包括:①抗体影响细胞膜上受体的分布或促其内化,导致神经元功能异常,如NMDAR[16]抗体。②抗体破坏抗原蛋白相互作用,如抗LGI1抗体阻断LGI1及其受体ADAM22/23的相互作用,进而影响下游信号通路[17]。③抗体刺激或拮抗受体,如GABABR[18]。④抗体-抗原复合物激活补体杀伤细胞以及抗体依赖性细胞毒性,如AQP4抗体[19]。MOG抗体在体外研究也发现有此机制,不过在体内需要同时有髓磷脂活化的T细胞的存在[20]。⑤抗体通过胞吞进入细胞内引起病理反应,比如SYN1抗体[21]。

过去十年内有数十种新自身抗体被报道,例如抗LUZP4,ATP1A3、SEZ6L2、syntaxin1B(STX1B)、GluRD2(GRID2)、PDE10A、AP3B2、septin3/5/6/7/11抗体等。由于神经系统自免病罕见,自身抗体有很高的诊断意义,许多新抗体一经发现,在实验室研究的同时即已应用到临床诊断中。基于细胞的间接免疫荧光染色技术(cell based assay,CBA)已成为大多数抗体检测的金标准,可用于临床诊断常规操作。使用啮齿动物或灵长动物脑切片,基于组织的间接免疫荧光染色技术(tissue based assay,TBA)或者培养的原代神经元进行间接免疫荧光,可以验证CBA检测结果,也可以指示新的自身抗体。

2 神经系统自身抗体检测方法

2.1 免疫印迹技术(包括western blot,免疫斑点/线技术)通常用于检测胞内抗原的自身抗体,如Hu, Yo抗体等,有很好的检测灵敏性。重组纯化的抗原固化在硝酸纤维素膜上(以小圆点/细线的形式),与患者样品孵育,再与酶标记的抗人IgG或IgM等免疫球蛋白的抗体孵育,之后加入底物使酶-底物发生显色反应,根据反应后显色深浅来判断抗体含量。Western blot方法是经过电泳转膜操作后再来检测自身抗体,参考了蛋白分子量,所以准确性高于免疫斑点/线方法,但操作也更复杂。一个试纸条上不同位置固化多种抗原,就可以多通量地同时检测多种抗体。缺点是这种方法的抗原构象在蛋白纯化过程中会受到破坏,检测AQP4抗体这类识别空间构象的抗体时会有比较高的假阴性率。

2.2 酶联免疫吸附实验(ELISA)ELISA是将重组抗原包被在96孔板的孔内,使用患者样品及酶标抗人免疫球蛋白二抗进行孵育,再经过酶底物显色,使用分光光度技术来测定自身抗体含量。ELISA技术已经相当成熟,自动化检测设备使抗体检测颇为便捷。缺点类似免疫印迹法,不适合检测识别构象的抗体。ELISA方法还因不适合多种抗体同时检测,在患者诊断检测时很少会被用到。

2.3 放射性免疫沉淀技术(RIA)RIA多用来检测抗神经元突触部位蛋白的抗体,尤其是检测一些由多个蛋白亚基构成的复合物的抗体,如抗AchR抗体、抗VGCC复合物抗体等。一般是使用放射性元素如碘125,标记重组抗原蛋白或有抗原表达组织/细胞匀浆物,与样品中自身抗体孵育后,加入一定比例的抗人IgG二抗或使用protein A/G琼脂糖使抗体-抗原沉淀下来,通过检测沉淀物的放射活性来分析自身抗体有无及含量。近年来放免法逐渐被其他方法(主要是CBA)取代。VGKC自身抗体中有临床意义的是抗LGI1和CASPR2两个蛋白,放免法被检测这两个抗体的CBA方法所取代[22];在AchR抗体检测上,CBA检测也被认为是灵敏度更高,对临床更有益处的检测方法[23, 24]。

2.4 CBACBA方法是在真核细胞(HEK293等)上过表达抗原蛋白,将活细胞或经固定处理的细胞与患者样品孵育,再使用荧光标记的抗人免疫球蛋白(IgG,IgM,及IgA等)的抗体进行孵育,最后通过荧光显微镜直接观察,或者使用流式细胞术进行分析。CBA方法的优点是位于细胞表达原位的抗原蛋白,相对于重组纯化的蛋白来说,可以更好地保留空间构象,有利于那些识别构象抗原位点的自身抗体的检出。与TBA相比,CBA实验对操作者要求较低,检测结果判断简单,只需要对实验组(过表达抗原的细胞)及对照组(转染空载载体的细胞)间的荧光信号强度进行比较,并结合少许阳性细胞形态的分析即可做出判断。CBA方法只能用来检测明确抗原的自身抗体,因此在寻找新自身抗体时一般是通过TBA而不是CBA来找到抗体存在的证据。

活细胞CBA和固定细胞CBA都被用来进行抗体检测,活细胞一般被认为保留了抗原最原始的构象,又由于活细胞细胞膜对抗体是不通透的,因此更适合检测识别表面抗原的抗体,如抗AQP4、MOG、GlyR[25]等。固定细胞的细胞膜通透,抗体可以进入细胞内部,可以用来检测抗表面抗体及胞内抗体。固定细胞CBA(商业化的试剂)在检测抗NMDAR抗体时,检测血清样品灵敏度为86%,脑脊液样品灵敏度92%,而活细胞CBA在血清样品上可以获得更高的灵敏度;在MOG自身抗体检测时,活细胞CBA也有更好的准确度,尤其是使用特异识别人IgG1二抗时[26, 27]。虽然有研究表明活细胞CBA在几个专业实验室之间有较好的一致性[28],但是细胞转染及染色操作等技术专业要求和时效性会限制其在临床实验室的使用。研究者认为目前过分关注细胞差别并无太多临床意义,抗体检测的时效性及可靠性(标准一致)更为关键[29]。

为明确各试样调制系数随电压的增长速率，对特定激励超声频率的各阶模态调制系数曲线进行一元线性回归分析，即根据若干实测点确定调制系数y与低频电压x的关系，回归函数记为

活细胞CBA试剂难以保存运输,目前只能实验室自建方法,固定细胞CBA则已有多种商业化产品上市,使用商业化CBA试剂适合在不同实验室达成共识,减少临床结论的分歧。商业化CBA试剂可以用于单项抗体检测,也可以将多种过表达细胞载片(单个尺寸1～5 mm2)组合在一张载玻片上,形成多通量检测试剂,用于多种自身抗体同时检测。随着大量新自身抗体快速被报道,当前的多通量检测试剂逐渐显露出局限之处:需要大量增加细胞爬片以适应日益增多的新自身抗体数量,在成本及技术上对生产厂商都是越来越大的挑战;实验人员也需要熟悉越来越多的阳性信号典型形态;检测操作也变得冗繁。这些都影响着新报道的抗体及时应用到临床。实验操作及结果判断自动化,同时使用更高通量的形式,比如检测芯片或者更高通量的流式细胞术等,有希望解决这种问题。

其中一种可行的解决方案是改变CBA试剂的形式[30]。保留CBA的抗原有天然构象的优点,将过表达细胞的膜-抗原复合物提取出来,固化到硝酸纤维素试纸条上,这个过程中控制条件使抗原空间构象不被破坏,之后使用免疫斑点法进行抗体检测。实验最终采用酶-底物显色方式,只需要根据颜色深浅来判断结果,不需要显微镜等设备,也不需要实验者持续训练来熟悉阳性细胞形态。目前这个方法在AQP4抗体检测上获得良好的结果,在多个实验中心与CBA方法比较均有非常好的一致性[30]。这种技术如果应用到更多的自身抗体检测中,比如MOG,NMDAR等抗体,一方面有利于床旁检测,方便在社区医院或者检测设备欠齐全的机构进行抗体检测[30];一方面便于开发抗表面自身抗体的高通量筛查试剂,在检测成本及效率上均有希望优于传统的CBA方法。

2.5 TBATBA也称为IIFA/TIF/TIIF,是在固定的啮齿或灵长动物神经组织切片上,使用患者样品进行间接免疫荧光/组化染色,来判断样品中有无自身抗体。一般会用到动物大脑(尤其是皮层、海马、丘脑等部位)、小脑、脑干、基底节、脊髓、外周神经、及肌肉(神经肌肉接头)等部位的组织切片。切片的不同固定条件及预处理方法,像使用甲醛、丙酮或其他固定试剂,以及快速冷冻切片后固定或先灌注固定蔗糖脱水后再冷冻切片等,会影响到不同抗体的检出[31],同时使用多种方式处理的组织切片可有利于抗体信号的检出。神经组织切片内含有各种抗原,可检出已报道的或未知的各种自身抗体,常用于新自身抗体研究中的样品筛查。

一些自身抗体的TBA信号模式被研究者描述的非常细致[31],理论上可根据信号模式推断自身抗体种类。不过有些种类的自身抗体信号模式比较接近,操作者需要大量训练熟知各种信号模式,并且样品中可能有不只一种抗体,以及同一类自身抗体可能存在抗体异质性,导致TBA信号模式并不总是清晰易辨。临床诊断时TBA需要结合抗原明确的CBA或者免疫斑点/线方法来使用。

目前对TBA与CBA方法的整体灵敏度及特异性的比较缺少明确结论,原因除了研究的抗体不同,样品入组标准或样品范围也不同,以及TBA实验操作和结果判断标准或有不同。一些已知的自身抗体,TBA较CBA检测灵敏度低的一个原因可能是组织内源表达抗原量较CBA过表达体系低,TBA使用的是动物组织切片,动物与人的抗原序列存在差异,使其不适宜用于某些抗体检测[32]。TBA如果不限于具体某自身抗体的验证,而用在判断有无抗体存在时有明显优势[33, 34]。有学者对TBA信号“模式”的诊断意义进行研究[35],通过对AE患者急性期收集脑脊液样品进行TBA实验,TBA信号模式可分为两类:神经纤维网模式和GFAP模式,其中以神经纤维网模式信号预测抗神经元抗体的灵敏度为66%,特异性为98.2%,明显高于常用的几个传统自身抗体的检测灵敏度。有专家建议在患者就诊时如果怀疑AE等疾病,可先使用TBA检测,阳性样品再辅以CBA或免疫印迹等确定自身抗体种类,这样可缩短确诊时间并提高诊断AE的准确度[33, 36]。

2.7 单细胞水平检测及抗体重组该方法所需技术水平较高,更适用于实验室研究,而非临床诊断。在一些患者自身抗体检测为阴性的情况下,如能找到产生自身抗体的细胞加以扩增,可以提高检测灵敏度[37]。方法是收集患者外周血或脑脊液,使用流式细胞分选等技术分离单个B细胞,进行单细胞克隆培养,并使用CBA方法检测培养液中的抗体表达情况,挑选出生产自身抗体的单细胞克隆,克隆抗体表达序列并重组抗体[37]。采用单细胞技术研究的自身抗体已有AQP4、MuSK、AchR、NMDAR、MOG、LGI1抗体[3],可以在无其它抗体干扰的情况下精确分析抗体的抗原识别位点、亲和力、致病机制、组织损伤位置等。神经系统免疫病自身抗体各种检测方法的系统比较见表1。

表1 神经系统免疫病自身抗体检测方法比较

3 样品类型及检测流程

神经系统自身抗体多数是外周骨髓产生,一部分抗体会在鞘内合成,或者通过病理损伤的血脑屏障进入中枢。多数中枢神经系统自身抗体可在血清及脑脊液中同时检出,如NMDAR抗体;有些抗原及病理部位远离神经中枢,其自身抗体只存在血清中,脑脊液中很少被检出,如抗AchR抗体。在临床上血清样品比脑脊液样品更容易获得,尤其在监测不同时间点的抗体水平时,多次抽取患者血样比较容易实现。血清中高浓度的无关抗体往往是导致假阳性检测结果的原因,脑脊液中无关抗体含量较少,用于检测会有更好特异性。一些AE自身抗体可以由鞘内产生的,并且有直接的致病性,因此中枢自免病检测脑脊液样品更有临床意义。脑脊液取样是侵入性的,不便于长期频繁取样。脑脊液的自身抗体一般含量较低,只检测脑脊液样品有假阴性的风险,像10%的LGI1抗体脑炎患者仅能在血清中检测到LGI1抗体[36]。因此对于中枢神经系统自免病,为获得尽可能高的检测灵敏度及特异度,推荐同时检测血清及脑脊液样品。

检测流程上一般推荐使用TBA筛查神经系统自身抗体信号,同时使用抗原明确的CBA或免疫斑点法对部分已知自身抗体进行筛查[1, 2]。一般实验室会根据对各种方法的熟悉程度,试剂获取及操作便利性,采用不同的检测流程,比如只进行CBA/免疫斑点检测;先进行CBA/免疫斑点检测,对阳性样品再使用TBA进行验证[38];先进行TBA筛查再使用CBA/免疫斑点确定抗体[33]等。在长期的检测工作中,这些不同的流程会分别带来不同的效果:较高的时效性但较低的检测准确度(仅CBA/免疫斑点);已知抗体检测准确度较高(先CBA/免疫斑点,阳性样品使用TBA验证)但会有大量样品的检测结果为阴性;大量的阳性检测结果(先TBA)但已知抗体检测为阴性(后CBA/免疫斑点)。无论采取何种流程,总有一定比例的样品检测结果使诊断变得比较困难。对每一例样品同时使用TBA和CBA/免疫斑点检测,并且在使用CBA/免疫斑点检测时,尽量全范围的涵盖已知自身抗体,这个理想的做法在流程上是完备的,不过实际工作中因时效性和检测成本的限制使之难以实现。TBA及CBA/免疫斑点检测试剂尽可能的商业化且生产标准化,开发涵盖已知自身抗体的高通量CBA/免疫斑点检测试剂,以及实验操作和结果判断自动化,使各个环节标准一致,才可能从技术根本上解决这个困境。

4 抗体的滴度

CBA或TBA实验中检测抗体滴度值来反映抗体浓度,对一个样品进行连贯梯度稀释并做CBA/TBA染色,阳性信号会依次减弱,选出能够观察到阳性信号的最大稀释倍数称为该样品的滴度值。

正常人可能带有一些低滴度的自身抗体,比如GAD65抗体可在8%的正常人体内检出,一些患者体内的低滴度GAD65抗体可能和其它系统性自身免疫病或1型糖尿病有关,通常不会表现出神经精神症状。抗体滴度高低是否可以反映病情轻重、进展状况以及治疗预后,目前还缺少足够的研究来证实。整体而言,自身抗体水平与病情危重程度的相关性比较弱。神经系统抗胞内抗体不能直接接触抗原,一般认为不具有直接致病性,高滴度并不一定会比低滴度更具有诊断特异性,在判断治疗是否有效及预后评估上,监控抗体的滴度意义也并不明显。抗表面抗体因为有直接致病的可能,一些研究认为滴度变化可用来评估治疗效果和预后,像高滴度的NMDAR抗体可预示较差的结局,患者治愈后继续监控脑脊液NMDAR抗体一定程度上可预测疾病复发的情况[39]。不过治愈后定期抽取脑脊液这一侵入性操作是否必需,还需要更强的研究数据来支持这一观点。在MOG抗体阳性的ADEM患者中也有类似发现,持续的血清检测阳性者88%会复发[40]。

5 临床诊断采用的抗体谱

传统的抗体谱筛查策略对近十余年来大量新发现的自身抗体应对不暇。这些新发现的自身抗体多是以个案报道的形式公布的,加上神经系统自免病的罕见和复杂性,若要明确某个神经系统自免病特异的抗体谱,往往需要一个漫长的时期和一系列的研究证明。比如AE已有几十年的研究历史,期间有大量的自身抗体被报道与之有关,但经过系统研究认为特异性足够好的自身抗体只有十余种[41],像NMDAR(脑脊液检出),LGI1,CASPR2(血清高滴度),AMPAR,GABABR,DPPX,GAD,Hu,Ma2,CV2,Amphiphysin,Tr。临床医师在对某些特定状况的疑似患者诊断时,会困惑于选择哪种或哪些抗体进行筛查,直接采用大范围抗体谱进行筛查往往在时间及成本上难以实现。队列研究对几十或几百例特定疾病状态患者进行抗体筛查并检出若干抗体,相对于个案报道来说,可提供较为系统的筛查方案以供参考。下面列举一部分经队列研究及综述分析的抗体谱。①免疫检查点(CTLA-4, PD-1, PDL-1)抑制剂治疗肿瘤出现神经系统自免性症状(ICIs)[42, 43]:有中枢症状的可检出Hu,CV2,amphiphysin,GFAP,NIF,Zic4,PDE10A,SOX1,LGI1,GAD65,NMDAR,GABABR,抗体,及低滴度的抗VGKC,P/Q型及 N型VGCC抗体;有外周神经症状(包括MG或肌病)的可检出CNTN2,AchR,RyR,LRP4,Titin,Kv1.4,神经节甘脂GM1/2和GalNAc-GD1a,氨酰tRNA合成酶,TIFg,横纹肌抗体。这些抗体中有一些可能是肿瘤本身产生的,与因药物产生的无法区分。ICIs的发生情况和临床表现非常复杂,不同研究中在ICIs检出抗神经抗体的概率差别比较大,可以从低到高至54%[42]。②小细胞肺癌伴有神经系统副肿瘤综合征[44]:Hu,Ri,Zic4,CV2,MAP1B,P/Q型及N型VGCC,GAD65,SOX1,AchR, gAchR,GABABR,AMPAR,GlyR,DACH1(ANNA3),及横纹肌抗体。③胸腺瘤伴有神经系统症状[45]:AQP4,AMPAR,GABAAR,GlyR,NMDAR,LGI1,Caspr2,VGKC,AchR,gAChR,CV2抗体。④中枢神经系统疱疹病毒感染伴有自免脑炎[46]:NMDAR,GABABR,GABAAR,AMPAR抗体。⑤新冠病毒(COVID-19)感染伴有神经精神症状[9, 47, 48]:Yo,Hu,Ma,Titin,ARHGAP31,GAD65,GFAP,AchR,D2R,MOG,NMDAR,CASPR2,MCTP1,myelin,甘脂GD1a抗体。⑥局灶性癫痫伴有轻度脑炎症状[49, 50]:LGI1,CASPR2,NMDAR,GABABR,GABAAR,Contactin-2,GlyR,AMPAR,GAD抗体。

由于神经系统自免病颇为罕见,只有少数的医学中心或者专业实验室有机会进行队列研究,这类文献发表较少。并且相对于新自身抗体报道的较高频率,商业化检测试剂种类更新明显滞后,实验室自建方法时也需要考虑到人工成本及技术熟悉程度,因此多数队列研究选取的往往不是覆盖比较全面的,而是范围较窄的“传统”抗体谱进行筛查。这种情况下若要总结出比较全面的抗体谱筛查方案,就需要若干研究共同积累足够数据,往往需要一个相当长的时间。

在这个抗体检测方案完善的过程中,临床遇到自免病怀疑指数很高的患者,使用某个抗体谱筛查为阴,甚至TBA检测也无明显的抗体信号,这种情况临床上并不罕见。目前认为抗体阳性数据的缺失并不能排除神经系统自身免疫病的诊断,临床需要综合考虑患者信息给以判断。同时实验室对检测方法进行改进,在能力时效及成本允许范围内适当扩大抗体谱筛查范围,以及对样品进行新自身抗体的寻找鉴定是更妥当的做法。

6 小结

现在虽然有多种神经系统自身抗体的检测方法,但由于每种方法都已发现有技术上的局限,加上神经系统免疫性疾病的复杂性及罕见性,目前的临床数据并不足以支持以某方法抗体检测结果作为疾病诊断金标准的结论。估计在相当长的时间内,对这类疾病的诊断仍需要多个指标同时考虑:症状、抗体、影像病理或其他特殊检测结果、病因/前驱疾病及病情发展情况,以及对一些治疗措施的反应。这样才能更准确地对患者状况、疗法选择及预后进行评估。

近些年来随着研究进展,抗体在临床诊断中越来越重要,抗体检测的精细及便利程度变化极大影响着临床上对疾病的理解和应对,专家共识中对症状、抗体等几个指标的解释及应用越来越精确翔实。可以预想未来标准化的高通量自动化检测方法将减少分歧,利于临床数据的迅速积累;新的自身抗体持续发现及应用,填补临床解释中的模糊之处;进而更有临床意义的抗体从众多抗体报道中被挑选出来,可以更具针对性地对致病机制和治疗方案进行研究。这些抗体靶点具体而且特异,将会使神经系统自免病为抗原特异性疗法的完美模型。