弱酸环境下食管内皮细胞活力与分泌因子的变化

林逊汀 欧阳慧 黄明城 林玉妹 谢晨曦

1 厦门大学附属中山医院消化内科（福建厦门 361004）

2 中山大学附属第七医院消化内科（广东深圳 518107）

3 中山大学附属第七医院肾内科（广东深圳 518107）

胃食管反流病（gastro-esophageal reflux disease，GERD）指的是由胃内容物反流引起的症状和/或并发症。传统观点认为，反流引起的粘膜损伤是从破坏食管表面上皮的完整性开始的，炎症逐渐向粘膜下层发展。但Dunbar KB发现，食管炎患者中断质子泵抑制剂治疗后，组织学上再次出现基底细胞间隙增宽、毛细血管扩张、乳头延长等表现，这些改变与粘膜是否存在破损无关［1］。我们既往的研究也发现，反流性食管炎、非糜烂性胃食管反流病（non-erosive reflux disease，NERD）及高敏性食管的患者均存在基底细胞间隙增宽（dilated intercellular spaces，DIS）的现象，DIS与食管酸暴露百分比时间不存在相关性［2］。Souza RF发现，胃反流物可以刺激食管上皮分泌细胞因子，募集炎症细胞［3］。炎症细胞自基底层向上皮浸润，导致炎症先自基层发生。这些结果提示，各种因素诱导上皮分泌细胞因子应是GERD重要的病理生理学机制。

酸反流（反流发作时食管pH≤4）是引起GERD的主要原因，对其已有深入的研究。而弱酸反流（反流发作时食管pH 4~7）可能在NERD中具有更大的作用，可以引起食管外症状，可能是难治性GERD的主要病因［4］。它是夜间反流的主要形式之一，严重影响患者的睡眠和生活质量［5］。目前对弱酸反流的研究相对较少，有必要进一步开展相关的工作。

p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）家族的重要成员，它参与了炎症、应激、细胞生长和凋亡等多种生理和病理过程。既往研究表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以促进RAW 264.7巨噬细胞系产生NO与IL-6，这与促进NF-κB的核转移有关。而抑制ERK1/2及p38的磷酸化，可显著减低巨噬细胞炎症因子的分泌［6］。这提示，p38 MAPK信号通路在调控炎症的过程中发挥重要的作用。但其在GERD发生发展中的作用，有待进一步研究。

本次研究，我们将采用体外试验的方法，探索弱酸刺激对人食管内皮细胞（human esophageal endothelial cell，HEEC）的影响，试图加深对GERD病理生理学机制的了解，并为临床诊疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

1.1.1 主要的实验材料 （1）细胞：HEEC，货号：BNCC359279，购自北纳生物科技有限公司；（2）CCK8试剂盒：货号：70-CCK810，购自联科生物技术有限公司；（3）IL-1β ELISA试剂盒：货号：EK101BHS，购自联科生物技术有限公司；（4）p38抗体：货号：cst8690T，购自Cell Signaling Technology（CST）公司；（5）p-p38抗体：货号：cst4511T ，购自Cell Signaling Technology（CST）公司；（6）二抗：Goat anti-Mouse IgG 与Goat anti-Rabbit IgG，货号：GAM007与GAR0072，购自联科生物技术有限公司；（7）ECL Plus发光试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）、Western及IP细 胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；（8）彩色预染蛋白分子量标准：购自Fermentas 公司。

1.1.2 主要仪器 （1）二氧化碳培养箱：3111型（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；（2）微光分光光度计：SMA4000型（美国 Merinton公司），配套使用的软件为 SMA4000 V4.2.3；（3）全波长酶标仪：SpectraMax Plus 384 型（美国Molecular Devices公司）；（4）倒置相差显微镜：ECLIPSE Ti-S型（日本 Nikon 公司）；（5）低速自动平衡离心机：TDZ4-WS型，湖南湘仪实验仪器有限公司；（6）台式高速冷冻离心机：TGL-16型，湖南湘仪实验仪器有限公司；（7）台式低速离心机：TDZ4-WS型，上海卢湘仪离心机仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞活力检测

1.2.1.1 细胞培养：将细胞置于含10% FBS、1%丙酮酸钠的MEM培养基中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。

1.2.1.2 铺板与换液：取正常培养的处于对数期的细胞，用0.25% Typsin+0.02% EDTA消化，1 000 rpm离心5 min，铺96孔，每孔均加入1×104个细胞，培养箱中过夜。

1.2.1.3 弱酸性培养基由H2SO4调节pH至6.0~6.5。实验分组为弱酸性组（pH 6.0~6.5）和中性组（pH 7.0~7.4）。分别加入对应培养基，培养箱中培养1 h，3 h和6 h。（共2个大组，6个亚组。每个亚组设置6个复孔，各测量6次数据）。

1.2.1.4 对应培养时间结束后，每孔加入10%的CCK8检测液，37 ℃避光反应1 h。于波长450 nm、650 nm处读取各孔OD值。

1.2.1.5 实验结果按以下公式计算：细胞活力（%）=实验组（OD450值-OD650值）/对照组（OD450值-OD650值）×100%。

1.2.2 Western Blot实验

1.2.2.1 分组：将实验组1（pH 6.0~6.5）和实验组2（pH 7.0~7.4）各分为3组。基线组设为0 h，之后分别培养2 h和6 h。（共2个大组，6个亚组，每个亚组的蛋白均测量3次）。

1.2.2.2 收集样品与电泳：将各组细胞样品收集到1.5 mL EP管中，每管中加入 200 μL Western及IP裂解液（使用前加入PMSF，终浓度1 mM），混匀后4 ℃充分裂解2 h，采用4 ℃离心机，12 000 r/min离心处理样品，分别取上清液储存。上样前加入5×上样缓冲液混匀，100 ℃放置10 min，迅速冰浴中冷却，上样量为每泳道约30 μg。在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电源，80 V恒压电泳至溴酚蓝跑完浓缩胶层，分离胶120 V恒压电泳，当溴酚蓝迁移至分离胶下缘时，关掉电源，停止电泳。

1.2.2.3 抗体孵育与显影：将PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中，置摇床上缓慢摇动，室温封闭1 h。取出已封闭的PVDF膜，加入一抗，4 ℃孵育过夜（p-p38、p38稀释比为1∶1 000，GAPDH稀释比为1∶5 000）。洗膜3次，每次10 min，之后孵育二抗（稀释比为1∶5 000），于室温摇床上孵育1 h。再次洗膜3次，每次10 min。将PVDF膜置于保鲜膜上，取适量ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。

1.2.3 ELISA检测

1.2.3.1 将实验组1（pH 6.0~6.5）和实验组2（pH 7.0~7.4）各分为3组。基线组均设为0 h，之后分别培养2 h、6 h。（共2个大组，6个亚组。每个亚组的IL-8和IL-1β，均测量9次样本数据）。

1.2.3.2 采用5 000 r/min 离心后取细胞培养液上清待用。将要用的ELISA 板用1×Wash solution 浸泡30 s，去尽洗液，尽量不要使孔板干燥。

1.2.3.3 标准品孔加入100 μL 2倍稀释的标准品，空白孔加入100 μL 标准品稀释液，其余孔加入待测样本100 μL，加上覆膜，300 r/min振荡，室温下孵育1.5 h。弃去液体，每孔加入350 μL 1×Washing buffer清洗，浸泡1 min，吸水纸上轻拍移除孔内液体，重复6次。

1.2.3.4 每孔加入100 μL稀释的检测抗体，加上覆膜，300 r/min振荡，室温下孵育0.5 h。弃去液体，每孔加入350 μL 1×Washing buffer 清洗，浸泡 1 min，吸水纸上轻拍移除孔内液体，重复6次。

1.2.3.5 每孔加100 μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加上覆膜，300 r/min振荡，室温下孵育0.5 h。弃去液体，如上述1.2.3.3中步骤进行清洗。

1.2.3.6 每孔加入100 μL稀释的信号增强剂，加上覆膜，300 r/min振荡，室温下孵育0.25 h。弃去液体，如上述1.2.3.3中步骤进行清洗。

1.2.3.7 每孔加100 μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加上覆膜，300 r/min振荡，室温下孵育0.25 h，弃去液体，如上述1.2.3.3中步骤进行清洗。

1.2.3.8 每孔中分别加100 μL TMB底物溶液，室温避光孵育5~30 min。在每孔中加入 100 μL Stop Solution，轻轻混匀，于波长450 nm和570 nm处读取OD值，进行数据分析。

1.2.3.9 将实验组1（pH 6.0~6.5）和实验组2（pH 7.0~7.4）各分为4个亚组。一组设为对照，另外3组中加入不同浓度的p38抑制剂SBS 203580（低浓度抑制剂为1 μM，中浓度抑制剂2 μM，高浓度抑制剂3 μM）。培养时间为6 h。其余ELISA检测步骤如上述。（共2个大组，8个亚组。每个亚组均测量9次数据）。

1.3 统计学分析

数据表示为平均值±标准差。使用单因素方差分析来比较差异。P值小于0.05被认为具有统计学意义。使用SPSS 23.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）完成统计分析。

2 结 果

2.1 不同培养条件下细胞活力的改变

HEEC细胞分别在中性（pH 7.0~7.4）和弱酸性（pH 6.0~6.5）环境下培养1 h，3 h和6 h。随着时间的延长，弱酸性组中的细胞活力下降。结果如表1所示。

表1 细胞活力（%）的对比 （）

表1 细胞活力（%）的对比 （）

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2.2 不同培养条件下p38和p-p38蛋白表达的变化

以0 h的蛋白水平设为基线。2个实验组基线的p38蛋白水平相似（P＞0.05）。与基线相比，随着培养时间的延长，2组的p38表达均没有明显变化（P＞0.05）。基线时，2个实验组中p-p38的含量没有显著差异（P＞0.05）。中性组中的p-p38含量随培养时间的延长，没有显著改变（P＞0.05）。在弱酸组中，p-p38的含量在培养2 h和6 h后，较基线水平均明显增加（P＜0.01），且高于同时段的中性组（P＜0.05）。其结果如表2与图1所示。

图1 弱酸培养促进食管内皮细胞内p-p38 的含量增加

表2 蛋白灰度值比值变化 （）

表2 蛋白灰度值比值变化 （）

注：灰度值比值指蛋白条带灰度值和内参灰度值的比值。

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2.3 不同培养条件下IL-8和IL-1β的表达情况

HEEC细胞分别在中性（pH7.0~7.4）和弱酸性（pH6.0~6.5）环境下培养。采用ELISA法检测基线时（0 h），以及培养2 h和6 h后上清中IL-8和IL-1β的浓度。我们发现，随着培养时间的延长，IL-8和IL-1β的浓度在中性组中无显著变化（P＞0.05）。弱酸组中，与基线时相比，IL-8和IL-1β的浓度在培养2 h和6 h后明显升高，且高于同时段的中性组（P＜0.01）。结果如表3和图2所示。

图2 弱酸培养促进IL-8 和IL-1β 的表达

表3 上清中IL-8和IL-1β浓度的变化 （，pg/mL）

表3 上清中IL-8和IL-1β浓度的变化 （，pg/mL）

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2.4 抑制p38激酶活性对IL-8和LI-1β的影响

和中性对照组相比，弱酸对照组I L-8 和IL-1β浓度升高（P＜0.01）。采用中性培养基的条件下，加入p38抑制剂后，和对照组相比，其余各组IL-8和IL-1β无显著变化（P＞0.05）。采用弱酸培养基的条件下，加入p38抑制剂后，和对照组相比，其余各组IL-8和IL-1β的浓度明显降低（P＜0.05）。结果如表4和图3所示。

图3 抑制p38 催化活性可以减少IL-8 和IL-1β 表达（培养6 h）

表4 加入p38抑制剂后IL-8和IL-1β浓度的变化 （，pg/mL）

表4 加入p38抑制剂后IL-8和IL-1β浓度的变化 （，pg/mL）

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3 讨 论

胃食管反流病是一种临床常见的疾病，在亚太国家，GERD的发病率有逐渐上升的趋势［7］。GERD最常见的症状是烧心和反流［8］。通常情况下，反流和烧心的主要病因是酸反流，它是决定食管炎严重程度的主要因素［4］。但在采用质子泵抑制剂治疗，症状仍然持续的患者中，非酸反流被认为是引起症状的主要原因［4，9］。在这部分患者中，大部分的反流事件是弱酸反流（pH4~7），碱反流（pH＞7）仅占很小的一部分［9-10］。因此，深入研究弱酸反流有利于加深对难治性GERD的了解，提高临床疗效。本次研究，我们采用体外实验，探索弱酸刺激对食管内皮细胞的影响。

我们发现，在1h以后，弱酸环境下的食管内皮细胞活力明显下降，而IL-8和IL-1β的表达明显升高。且随着培养时间的延长，该现象越明显。这提示，弱酸刺激可能通过炎症级联放大效应促进食管细胞死亡和组织损伤。IL-8和IL-1β由巨噬细胞和多种组织细胞释放。既往研究表明，非酸反流可以促进食管鳞状上皮细胞分泌IL-8和IL-1β，趋化炎症细胞，使黏膜固有层或更深层的感觉神经元暴露于炎症介质，引发症状［1，11-12］。这和我们的结果相符。胃食管反流病的组织病理学特征，如基底细胞增生，乳头状延长，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润均与黏膜中较高水平的IL-8相关［13-14］。在高脂饮食的小鼠模型中，IL-8是促进食管上皮不典型增生的关键因子［15］。反流性食管炎患者采用兰索拉唑治疗，可以促使黏膜的IL-8水平显著下降［13］。半胱天冬酶1可以被炎症小体激活，导致包括Il-1β在内的诸多炎症因子的产生，触发食管细胞焦亡。这与食管炎和食管癌的发生有关［16］。在存在严重症状或症状反复发作的GERD患者中，对IL-1β单核苷酸多态性的评估有利于识别具有巴雷特食管和食管癌风险的患者［17］。我们认为，进一步研究弱酸对食管内皮细胞所处的免疫微环境的影响，将有利于加深对NERD发病机制的了解。

本次研究，我们发现，p38的总量并没有随着培养时间的延长而增加，也不受培养基pH值的影响。但其活性形式p-p38在弱酸刺激下明显增加。酪蛋白激酶2（CK2）是p38重要的下游底物，可以引起IκBa的泛素化降解，促进NF-κB的核易位，也可以通过磷酸化P65/RelA，增强NF-κB与DNA位点的结合力［18］。如果食管上皮长期暴露于胃反流物中，会触发细胞发生基因突变。如果突变发生于肿瘤蛋白p53基因，突变的p53可以与NFκB一起促进肿瘤的发展［19］。在GERD患者的食道黏膜中发现了NF-κB的激活，并且NF-κB亚基主要定位于表达IL-8的细胞的细胞核中［20］。因此，我们推测，对于GERD患者，p38 MAPK信号通路可能具有调节相关炎症反应的作用。SB 203580被广泛用于分析p38 MAPK在各种生理过程中的作用。SB 203580对p38的激活没有影响，主要起到阻断p38 MAPK的催化活性的作用［21］。激活的p38能够自我活化，增加细胞内p-p38的含量，而SB203580能够抑制这种正反馈调节。我们发现，加入p38抑制剂后，IL-8和IL-1β的表达明显下降，且随着抑制剂浓度的增强，下降趋势越明显。这表明，在弱酸反流的过程中，p38相关信号通路的激活具有促进炎症的作用，抑制p38 MAPK可能是一种潜在的治疗GERD的方案，但还需体内实验进一步验证。

本次研究存在以下不足之处：第一，仅采用CCK8实验检测细胞活力，未进一步检测凋亡相关蛋白、细胞紧密连接蛋白等的表达，也未进行细胞周期检测，故未能完整、系统的揭示弱酸刺激对食管细胞功能的影响，这在未来的实验中将进一步验证；第二，我们未进行动物模型的构建，体外实验的结论能否在体内实验中重现，需要进一步的研究。

综上所述，弱酸培养导致食管内皮细胞活力下降，炎症因子的表达增加。抑制p38的激酶活性可以减少IL-8和IL-1β的产生，从而抑制炎症。进一步开展关于p38 MAPK信号通路的研究，可以加深对难治性GERD发病机制的理解，开拓临床治疗思路。