基于指纹图谱结合一测多评法评价不同产地牻牛儿苗质量

孙仁爽，隋艳艳，闫 红，张立秋，顾地周，陈新连

基于指纹图谱结合一测多评法评价不同产地牻牛儿苗质量

孙仁爽1，隋艳艳2，闫 红3，张立秋1，顾地周4，陈新连5*

1. 通化师范学院医药学院，吉林 通化 134002 2. 吉林省通化振国药业有限公司，吉林 通化 134002 3. 吉林玉仁制药股份有限公司，吉林 通化 134002 4. 通化师范学院生命科学学院，吉林 通化 134002 5. 中山大学药学院，广州 广东 510006

建立牻牛儿苗的指纹图谱，并同时建立其中4个酚酸类成分含量的一测多评分析（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）方法，以期对牻牛儿苗药材进行整体质量控制。以没食子酸为参照峰确定共有峰，建立牻牛儿苗的高效液相色谱指纹图谱；以没食子酸为内标，确定柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的相对校正因子并计算含量，实现一测多评。同时采用外标法测定4个成分的含量，比较计算值和实测值的差异。建立了牻牛儿苗的HPLC指纹图谱，10批样品相似度均在0.891以上；以没食子酸为内标建立的柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的相对校正因子分别为0.751、0.214和0.444，重现性良好，10批牻牛儿苗样品QAMS法计算值与实测值无显著差异。所建立的指纹图谱结合QAMS简便可行，可为牻牛儿苗药材整体质量控制提供参考和依据。

牻牛儿苗；指纹图谱；一测多评法；相对校正因子；没食子酸；柯里拉京；老鹳草素；鞣花酸

牻牛儿苗是牻牛儿苗科牻牛儿苗属牻牛儿苗Willd.植物的干燥地上部分[1]，用于风湿痹痛、麻木拘挛、筋骨酸痛、泄泻痢疾。牻牛儿苗的主要化学成分为鞣质和黄酮类，包括老鹳草素、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、山奈酚和槲皮素苷等[2]。近年来，随着人们对牻牛儿苗及鞣质药理活性研究的深入，越来越多的鞣质新活性被发掘出来，鞣质的药理活性已不止于收敛固涩，而广泛应用于抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肝病、止血及抗肿瘤等领域[3]。没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸是牻牛儿苗主要鞣质类成分[4-5]，是牻牛儿苗抗病毒、抗肿瘤等作用的药效物质基础，因此本实验选择没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸作为指标成分进行测定。《中国药典》2020年版对牻牛儿苗药材定量指标仅有水溶性浸出物“不得少于18.0%”。目前使用常规方法以多成分含量测定来评价牻牛儿苗药材质量的研究已有报道[6]，但这些方法所需对照品量大，长期以来面临着对照品难求、价格昂贵、货源紧缺等问题，难以推广至牻牛儿苗药材质量控制的实际应用中。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）采用单一对照品同时测定多个成分的含量，是实现中药多成分质控的一种经济、简便的分析方法[7]。而中药指纹图谱是中药整体质量控制的核心技术之一，可以反映不同样品质量的均一性[8]。为解决对照品的缺乏导致的多组分同时定量的矛盾，本实验采用高效液相色谱方法，建立了指纹图谱结合QAMS法的牻牛儿苗质量评价方法，在较全面表征牻牛儿苗化学成分整体轮廓、评价牻牛儿苗药材整体质量的基础上，同时对主要成分进行含量测定，为牻牛儿苗多指标质量控制推广提供参考[9-11]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安U3000高效液相色谱仪（含P680泵、ASI-100自动进样器、PDA100紫外二级管阵列检测器和变色龙工作站）、Agilent1260高效液相色谱仪（含四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和DAD检测器）、Waters E2695高效液相色谱仪（含alliance 2695型泵、alliance 2695型自动进样器、2489型紫外检测器和empower3型工作站）、岛津20A高效液相色谱仪（含LC-20AD泵、SPD-20A紫外检测器、LCsolution色谱工作站、SIL20A自动进样器、CTO-10A柱温箱）、大连依利特1100梯度高效液相色谱仪（含恒流泵D1100、紫外-可见检测器1100、色谱柱恒温箱、Elitapex色谱数据工作站）和上海伍丰LC-100高效液相色谱仪（P100高压恒流泵、UV100紫外检测器、恒温柱箱和WS100工作站）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公温司）；CPA225D型十万分之一电子天平（赛多利斯公司）。

1.2 试药

色谱甲醇和色谱乙腈（迈瑞达科技公司）；甲醇和磷酸为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）；娃哈哈纯净水。对照品没食子酸（110831-201906，质量分数以91.5%计）、柯里拉京(111623-200302，质量分数≥98%）、鞣花酸（111959-201903，质量分数以98.8%计）均购自中国食品药品检定研究院；老鹳草素（100503，质量分数≥98%）购自上海融禾医药科技有限公司。10批牻牛儿苗药材（表1）经通化师范学院医药学院于俊林教授鉴定为牻牛儿苗Willd.的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对照品适量，加入甲醇制成含没食子酸232.34 μg/mL、柯里拉京120.52 μg/mL、老鹳草素50.30 μg/mL、鞣花酸150.26 μg/mL的混合对照品储备液。

表1 10批牻牛儿苗药材产地信息

2.2 供试品溶液的制备

取牻牛儿苗药材粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加入70%丙酮溶液18 mL，精密称定，超声（频率100 kHz）提取60 min，浓缩，用甲醇定容至100 mL量瓶中，得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：安捷伦XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.3%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）-甲醇（C），梯度洗脱：0～5 min，95%A；0%～3% B，5%～2% C；5～10 min，95%～91% A；3%～8% B，2%～1% C；10～35 min，91%～89% A；8%～10% B，1% C；35～45 min，89%～86% A；10%～14% B，1%～0 C；45～65 min，86%～85% A；14%～15% B，0% C；65～80 min，85%～70% A；15%～16% B，0～14% C；80～90 min，70%～57% A；16%～17% B，14%～26% C；体积流量0.8 mL/min；进样量10 μL；检测波长278 nm。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，以没食子酸为参比峰，各共有峰的相对保留时间RSD为0.65%～2.74%和相对峰面积RSD为1.78%～2.69%。

2.4.2 重复性试验 精密称取同一批药材粉末6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液进行测定，以没食子酸为参比峰，各共有峰的相对保留时间RSD为0.87%～2.50%和相对峰面积RSD为0.32%～2.43%。

2.4.3 稳定性试验取同一供试品溶液，在室温下放置，分别于0、4、8、12、24 h测定，以没食子酸为参比峰，各共有峰的相对保留时间RSD为0.57%～3.28%和相对峰面积RSD为0.76%～4.26%。

2.4.4 指纹图谱建立及相似度评价 将上述10批样品的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版》软件进行相似度评价[12]，设定S1为参照，多点校正、匹配，得到的10批牻牛儿苗HPLC叠加图谱见图1。生成的牻牛儿苗对照指纹图谱见图2，可作为牻牛儿苗鉴别的特征图谱。牻牛儿苗样品共有峰峰面积见表2，10批牻牛儿苗药材有9个共有峰，通过对照品确认1号峰为没食子酸、6号峰为柯里拉京、7号峰为老鹳草素、8号峰为鞣花酸。共有峰的保留时间差异较小，保留时间RSD小于0.33%；峰面积差异较大，RSD为33.88%～158.15%。可能与牻牛儿苗属于广分布品种，不同的生长环境影响植物的次生代谢；所采集的样品生长年限不同；果、茎叶和花等不同药用部位比例差异较大，药材的不同部位有效成分含量有着显著的差异有关。10批样品与对照图谱比较，相似度评价结果分别为0.992、0.985、0.986、0.987、0.994、0.991、0.891、0.909、0.973、0.997，可为牻牛儿苗药材的品质评价提供科学依据。

图1 10批牻牛儿苗HPLC叠加图谱

1-没食子酸 6-柯里拉京 7-老鹳草素 8-鞣花酸

2.5 多成分含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备 按照“2.1”项制备混合对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备 按照“2.2”项制备供试品溶液。

2.5.3 色谱条件 色谱条件同“2.3”项。混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图3。

表2 10批样品共有峰峰面积

1-没食子酸 2-柯里拉京 3-老鹳草素 4-鞣花酸

2.5.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取混合对照品溶液，按上述色谱条件测定，以进样量为横坐标（），峰面积为纵坐标（），得到各成分的回归方程及线性范围。结果表明4个酚酸类成分在线性范围内线性良好，结果见表3。

2.5.5 精密度试验 取混合对照品溶液，重复进样6次，计算各成分峰面积的相对标准偏差，结果没食子酸的RSD为1.2%，柯里拉京的RSD为1.9%，老鹳草素的RSD为1.0%，鞣花酸的RSD为1.4%，表明仪器的精密度良好。

表3 4个酚酸类成分的标准曲线

2.5.6 稳定性试验 取样品溶液分别于0、4、8、12、24 h测定，样品中没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸不同时间峰面积的RSD分别为1.3%、1.7%、1.4%、1.9%。表明牻牛儿苗样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.7 重复性试验 取牻牛儿苗药材，粉碎，取6份分别精密称定，制备样品溶液，测定，计算各样品溶液中没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的含量。结果没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸分别为2.05、1.24、0.42和1.45 mg/g，RSD分别为2.7%、2.3%、2.5%和2.8%，表明方法的重复性较好。

2.5.8 加样回收率试验 取牻牛儿苗粉末约1 g，精密称定6份，按药材中的量和对照品量1∶1左右加入相应的对照品溶液[13]，制备样品溶液，计算平均回收率，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的平均回收率分别为101.3%、99.5%、103.1%、99.8%，RSD分别为2.3%、1.9%、2.5%、1.7%，表明方法的准确性较高。

2.6 一测多评方法建立

2.6.1 相对校正因子（）计算 在一定的线性范围，成分的量（质量或浓度）与检测器响应成正比。在多指标（s，a，b，…，，…）质量评价时，以药材中某一典型有效成分作内参物（s），建立内参物与其它待测成分（a，b，…，，…）间的（sa、sb、sc，…），按下式计算：

si＝s/f＝s×C/s×A

s为内参物对照品s峰面积，s为内参物对照品s浓度，A为某待测成分对照品峰面积；C为某待测成分对照品浓度[15]

取混合对照品溶液进样，记录各成分的峰面积，以没食子酸为内参物，计算其他组分与内参物的。结果表明，以没食子酸为内参物，其他成分的的RSD均小于3%，结果见表4。柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对没食子酸的分别为0.751、0.214和0.444。

2.6.2的耐用性考察

（1）不同仪器考察：精密吸取混合对照品溶液5 μL，进样分析。计算柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对没食子酸的相对校正因子。分别考察了戴安U3000、Agilent1260、Waters E2695、岛津20A、依利特1100梯度和伍丰LC-100等6台高效液相色谱仪，结果见表5，不同相对校正因子的RSD均在3%以下。

表4 牻牛儿苗中4个酚酸成分相对校正因子

表5 6台仪器得到的相对校正因子

（2）不同实验室考察：考察了QAMS法在不同实验室的结果，不同实验室测得相对校正因子见表6。相对校正因子的RSD在2.74%以下，说明不同实验室测定结果差异较小。

2.6.3 柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸色谱峰的定位 单独用没食子酸做对照品进行含量测定，柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的色谱峰准确定位非常关键。以柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对没食子酸的保留时间差和相对保留值作为考察指标，并验证了二者在不同品牌仪器中的重复性。不同仪器目标成分间保留时间差结果见表7，不同仪器保留时间差的RSD值在0.89%～2.25%。不同仪器目标成分的相对保留

表6 不同实验室得到的校正因子

表7 不同仪器目标成分间保留时间差

值结果见表8，RSD值在1.23%～2.14%，柯里拉京、老鹳草素、鞣花酸和没食子酸的DAD紫外光谱图见图4，4个成分在220 nm和270 nm左右均有2个吸收峰，其中220 nm左右为最大吸收波长，但是2个峰的形状和峰高的比值不同，可用于4个成分的指认。因此，采用柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对没食子酸的保留时间差或相对保留值结合二极管阵列检测器的紫外光谱图，可准确指认牻牛儿苗中的目标色谱峰。

2.6.4 QAMS法与外标法结果比较 为验证QAMS法的准确性，本实验采用外标法进行比较。收集10批不同产地牻牛儿苗，分别采用QAMS法和外标法测定其没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的含量，2种方法所得的各批次药材的含量和相对误差情况见表9。10批牻牛儿苗药材中柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的含量分别为0.258%～1.378%、0.284%～1.589%和0.299%～1.852%。不同产地和采收期4个成分的含量均呈现一定的动态变化，但规律不一致。其中柯里拉京在黑龙江大庆的产地含量最低，大连瓦房店的产地含量最高。老鹳草素在吉林松原市产地含量最低，吉林白城产地含量最高。鞣花酸在河北沽原县的产地含量最低，辽宁锦州黑山县的产地含量最高[15]。两法所得到的含量值之间用Pearson相关系数进行比较，结果柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸计算值与实测值的简单相关系数均为1，说明两法得到的含量的相似性极高；两种方法得到的柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸含量的相对误差为 0.11%、0.29%和0.23%，说明QAMS法可准确测定牻牛儿苗中没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸的含量。

表8 不同仪器目标成分的相对保留值

图4 4个成分的DAD紫外光谱图

3 讨论

本实验选用70%丙酮为溶剂对牻牛儿苗中的总鞣质进行提取，通过干酪素法对总鞣质含量进行测定，确定牻牛儿苗总鞣质的最佳提取工艺[16]。鞣质的经典含量测定方法有很多种，最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合滴定法、比色法和分光光度法。皮粉法适用的范围非常广，但是耗用样品多，测定时间长，而且没有选择性，其测定结果往往偏高。同皮粉法一样，高锰酸钾法选择性小，易受样品中还原性物质干扰，误差较大。干酪素法测定鞣质含量的优点在于干酪素能有选择性地结合有生理活性的鞣质，因此测出来的是有疗效的鞣质，而无疗效的鞣质，如鞣酐则不被测定。

表9 QAMS法和外标法测定4种成分的含量与相对误差

本实验通过高效液相色谱仪的二极管阵列检测器得到的三维图谱比较发现，以278 nm检测波长能够较好地检测出牻牛儿苗药用植物的主要有效成分，故选择278 nm作为测定波长。

本实验采用HPLC法建立了牻牛儿苗的指纹图谱，采用QAMS的质量控制方法，一次分析中可同时测定4个成分的含量。10批牻牛儿苗药材共标定了9个共有峰，所有样品的相似度均高于0.891，所建立的指纹图谱可用于牻牛儿苗药材的整体质量评价。本实验通过对照品确认了4个共有峰，并同时建立了QAMS的含量测定方法。以没食子酸为内标，柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸在278 nm下的校正因子分别为0.751、0.214和0.444。以QAMS法和外标法计算得到的含量结果之间无明显差异，表明所建立的QAMS方法准确，可用于牻牛儿苗药材的多成分含量测定。QAMS法结合指纹图谱技术，既发挥QAMS法简便、易行、经济的优点，又体现指纹图谱整体、全面的优势。指纹图谱与含量测定采用同一方法，简化了分析过程，降低分析成本。所建立的方法同时达到定性、定量2个目的，可作为牻牛儿苗药材的质量评价方法。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Application of fingerprint combined with quantitative analysis of multi-components with a single-marker in quality evaluation of

SUN Ren-shuang1, SUI Yan-yan2, YAN Hong3, ZHANG Li-qiu1, GU Di-zhou4, CHEN Xin-lian5

1. Medical College ,Tonghua Normal Univetsity,Tonghua 134002, China 2. Jilin Tonghua Zhenguo Pharmaceutical Co.,Ltd, Tonghua 134002, China 3. Jilin Yuren Pharmaceutical Co., Ltd, Tonghua 134002, China 4. College of Life Sciences,Tonghua Normal Univetsity, Tonghua 134002, China 5. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat⁃sen University, Guangzhou 510006, China

To establish the fingerprint ofWilldand a single standard for determination of multiple components method was used to determine the content of four main components simultaneously, in order to control the overall quality ofUsing gallic acid as the reference peak, the common peaks were determined to establish HPLC fingerprint ofGallic acid was selected as internal reference and the relative correction factors (RCF) of four components were calculated and the contents were calculated by QAMS. Meanwhile, the contents of four components inwere determined by external standard method. The accuracy and feasibility of QAMS was evaluated by comparing the results between the measured values by external standard method and calculated values by QAMS.The HPLC fingerprint ofwas established and the similarity of fingerprints of 10 batches of test samples were above 0.891. The RCF of corilagin,geraniin and ellagic acid were 0.751, 0.214 and 0.444 and showed good reproducibility. The contents of four components showed no significant difference in the 10 batches ofdetermined by external standard method and QAMS.The established fingerprint combined with QAMS method are simple and feasible, which can provide some reference and basis for the overall quality control of

Willd.; fingerprint; QAMS; relative correction factor; gallic acid; corilagin;geraniin; ellagic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21 - 7186 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.027

2023-05-16

国家自然科学基金项目（81973431）；通化师范学院应用研究项目—中药质量评价研究（01054）

孙仁爽，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药药效物质基础和质量控制研究。

通信作者：陈新连，女，博士，研究方向为中药资源及分子生药学。E-mail: 804590217@qq.com

[责任编辑 时圣明]