基于UPLC-MS/MS的毛竹笋不同生长阶段差异代谢物分析

郭明阳，贺曰林，潘凯婷，鲍方艳，应叶青

（浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300）

毛竹（Phyllostachys edulis）是我国分布范围最广、面积最大的经济竹种[1]，具有生长迅速且环境适应力强的特点。毛竹笋是我国传统的“森林蔬菜”之一[2]，其味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、膳食纤维、多糖等多种营养物质以及微量元素[3]，并且具有抗氧化、抗炎症、降压等多种功能，是一种天然的保健品。

果蔬的生长发育是一个复杂的代谢过程，代谢产物的动态变化与果蔬品质变化密切相关。代谢组学是一种能够对样本中所有内源性小分子代谢物进行识别和量化的分析方法[4]，在许多果蔬中已被广泛应用。例如在百香果[5]中证实了脂类、有机酸和酚酸含量的显著减少和糖醇的积累与果实口感和香气变化密切相关；在枣果皮[6]中揭示了其颜色变化不同时期黄酮化合物的富集情况；在猕猴桃中识别了不同发育阶段5 种营养代谢物水平的动态变化。而在竹笋中，通过代谢组学手段确定了竹笋的苦味主要由L-苯丙氨酸、尿苷、L-丙氨酸、L-色氨酸、腺嘌呤等组成[7]，还对竹笋采后低温环境下的木质化网络进行了研究[8]。

毛竹笋的生长速度极快，在条件适宜的春季，甚至一天能生长1 m，因此笋生长过程中营养物质会发生剧烈变化。Song Xinzhang等[9]研究表明在毛竹笋快速生长期，母竹可以为竹笋提供大量的碳水化合物。Wang Shuguang等[10]发现竹笋出土时笋中的淀粉和蔗糖会分解为单糖，用于竹笋生长。李紫阳等[11]证明随着毛竹笋高度增加，木质化程度和木质素含量显著增加。然而对于竹笋不同出土高度的代谢物变化情况尚不明晰。因此本研究基于广泛靶向代谢组学方法对3 个不同生长阶段的毛竹笋进行分析，同时与基本营养指标测定结果相结合，阐明毛竹笋差异代谢物的动态变化情况，旨在为毛竹笋的营养价值研究以及毛竹资源的开发与科学利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛竹笋样品采集于浙江省杭州市临安区毛竹示范培育基地（30°13’54”N；119°48’2”E），为比较毛竹笋生长不同时期的代谢产物变化，采集5、20、40 cm出土高度的竹笋，根据竹笋的生物学特性，划分为竹笋生长的3 个不同时期，5 cm代表破土期、20 cm代表生长期、40 cm代表快速生长期，并将其编号为S1、S2、S3，各时期毛竹笋生长情况如图1所示。每个时期样本采集3 个生物学重复（每个重复3 颗笋），竹笋剥去笋壳切去基部不可食用部分后，采集竹笋中部，然后立即于液氮中冷冻，并在-80 ℃冰箱中贮藏。

图1 毛竹笋不同时期生长情况Fig.1 Photographs of P. edulis shoots at different growth periods

甲醇、乙腈（均为色谱纯）德国Merck公司；标准品（色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Nexera X2超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）仪 岛津（中国）有限公司；4500 QTRAP串联质谱（tandemmass spectrometry，MS/MS）仪 美国Applied Biosystems公司；Scientz-100F普通型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；MM 400研磨仪 德国Retsch公司；CR-10 plus型色差仪 日本Konica Minolta公司；TA.XT plusC质构分析仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 生理指标测定

色度使用色差仪进行测定[12]；硬度使用质构分析仪进行测定[13]；可溶性糖、淀粉和纤维素含量采用蒽酮比色法进行测定[14]；游离氨基酸含量采用茚三酮显色法测定[15]；总酚含量采用福林-酚比色法进行测定[16]；黄酮含量采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行测定[17]；全氮采用凯氏定氮法进行测定[15]；VC含量采用红菲咯啉比色法测定[18]；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[15]；木质素含量采用乙酰化法进行测定[19]；总灰分按照GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》进行测定；粗脂肪含量采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的酸水解法进行测定。

1.3.2 样品的提取

将竹笋样品放置于冻干机中真空冷冻干燥，用研磨仪在30 Hz条件下研磨至呈粉末状；精确称取100 mg研磨后的粉末，将其溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液中，在4 ℃条件下过夜；将溶解后的溶液每30 min涡旋1 次，每次持续30 s，共涡旋6 次；然后12000 r/min离心10 min，在UPLCMS/MS分析前，上清液采用0.22 µm微孔滤膜过滤。

1.3.3 基于UPLC-MS/MS系统的广泛靶向代谢组学分析

样品提取物分析使用UPLC-MS/MS系统。UPLC分析条件：色谱柱Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相A为超纯水（0.1%甲酸），流动相B为乙腈（0.1%甲酸）；洗脱梯度：0.00 min，95% A，5% B；0.00～9.00 min，95%～5% A，5%～95 % B；9.00～10.00 min，5% A，95 % B；10.00～11.10 min，5%～95 % A，95%～5% B；11.10～14.00 min，95% A，5% B。将后续流出物连接到三重四极杆线性离子阱质谱仪上。质谱条件：电喷雾电离源，温度550 ℃；离子喷雾电压5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I、气体II和气帘气分别设置为50、60 psi和25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。通过进一步去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化，完成各个多反应监测离子对的DP和CE。

1.4 数据分析

生理指标测定中单个因素重复测定3 次，利用IBM SPSS Statistics 25.0进行单因素方差分析，并采用隶属函数法对毛竹笋各生长阶段的营养指标进行综合评价，其公式为：

式中：Xij为i阶段j成分的测量值；Xjmin为所有阶段j成分的最小值；Xjmax为所有阶段j成分的最大值；i为某个生长时期；j为某项指标。

广泛靶向代谢组学数据利用迈维（武汉）生物技术有限公司自建MWDB数据库、MultiaQuant软件以及Analyst 1.6.3软件进行代谢物定性定量分析。结合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）以及聚类分析对代谢组学数据完成多角度分析。基于OPLS-DA结果，将获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）与单变量分析的差异倍数（fold change，FC）结合，筛选出不同生长阶段差异的代谢物。热图采用迈维云平台绘制。

2 结果与分析

2.1 毛竹笋不同生长阶段的形态及营养成分变化

如图2所示，S1期竹笋整体呈乳白色，到S3期变为黄绿色。色度值也印证了这一点（表1），S1到S3总色差显著增加，亮度值无显著差异，黄度值显著增加。竹笋硬度随竹笋高度的增加也呈显著上升的趋势。

表1 毛竹笋不同生长阶段形态与营养指标Table 1 Changes in hardness,color and nutritional indexes of P. edulis shoots at different growth stages

图2 不同生长阶段毛竹笋表观形态变化Fig.2 Changes in visual appearance of P. edulis shoots at different growth stages

糖类可以直接为人体提供能量，总糖是影响竹笋风味的因素之一[20-21]。如表1所示，毛竹笋中可溶性总糖含量随生长高度的增加呈下降趋势，由S1期的5.88 mg/g下降到S3期3.88 mg/g。与此同时，淀粉和纤维素的含量随生长高度增加而上升，在S3期含量达到最高。笋是人类潜在的蛋白质来源，在毛竹笋S3阶段，笋体内可溶性蛋白含量显著下降，全氮含量也呈相同的趋势。笋中蛋白质的消耗速率增加会导致其存储的蛋白质大量减少，因此可溶性蛋白和全氮含量的下降可能与S3期竹笋生长速率加快密切相关。游离氨基酸含量在毛竹笋的S2～S3阶段显著下降，氨基酸也是笋品质的重要评价指标[22]。此外，灰分与粗脂肪含量随生长高度的增加含量上升，S3期灰分质量分数达到了9.52%，粗脂肪含量达到4.50%。

如表1所示，随生长高度增加，毛竹笋中总酚含量在生长期S2达到最高，在S3期显著下降到5.87 mg/g。总黄酮和VC含量在S1到S2期间显著下降，S3期含量基本不变。此外，竹笋中的木质素含量由S1期的6.33%迅速上升，到S3含量达到9.27%，竹笋中木质素含量的增加会导致口感品质的下降。

2.2 竹笋不同生长阶段营养品质综合评价

如表2所示，破土期、生长期与快速生长期平均隶属函数值分别为0.75、0.45和0.15，隶属函数值越大，代表综合品质越好，说明毛竹笋破土期具有较好的营养和风味品质。

表2 主要营养品质指标的隶属函数值Table 2 Membership function values of major nutritional quality indexes

2.3 毛竹笋不同生长阶段代谢物总体分析

通过UPLC-MS/MS手段对毛竹笋3 个阶段的代谢产物进行鉴定，共鉴定出765 个化合物。这些代谢物被分为13 类（图3）。检测到的所有代谢产物中，脂类化合物数量最多（19.3%），其次是酚酸类（18.8%）、氨基酸及其衍生物（12.4%）、生物碱（9.3%）、有机酸（9.2%）、糖及醇类（7.8%）、核苷酸及其衍生物（7.1%）、黄酮（5.5%）、木脂素和香豆素（2.5%）、维生素（2.5%）、萜类（2.2%）和醌类（0.4%）。

图3 毛竹笋所有代谢产物的分类Fig.3 Classification of all metabolites of P. edulis shoots

为确定不同生长阶段竹笋的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，对9 个样品（3×3 个生物重复）进行PCA和相关性分析。PCA结果表明（图4），PC1可以解释不同生长阶段的总方差和分离样本的32.9%，PC2能解释总方差的15.7%，说明在毛竹笋生长的不同阶段，代谢产物的积累模式存在较大差异。通过相关性分析（图5）发现竹笋各重复间的相关均大于0.92。上述结果表明，不同生长阶段组内有较好的重复性，所获得的代谢组数据可靠。

图4 毛竹笋不同生长阶段代谢组样品间PCAFig.4 PCA plot of metabolome samples in P. edulis shoots at different growth stages

图5 毛竹笋不同生长阶段代谢组样品间相关性分析Fig.5 Correlation analysis among metabolome samples of P. edulis shoots at different growth stages

2.4 毛竹笋不同生长阶段差异累积代谢物分析

为了进一步了解竹笋生长不同阶段（S1 vs S2，S2 vs S3）之间的代谢差异，对差异累积代谢物（differentially accumulated metabolites，DAMs）进行分析，在筛选条件FC≥2或FC≤0.5且VIP＞1下，共筛选到203 个DAMs，每组的DAMs数量如图6所示。S1与S2共鉴定到90 个DAMs，其中有51 个呈上调趋势，39 个呈下调趋势。在S2与S3中共鉴定到63 个DAMs，其中23 个呈上调表达，40 个呈下调表达。

图6 不同对比下DAMs的统计Fig.6 Statistics of DAMs under different contrasts

进一步通过聚类分析对发育过程中代谢组的动态变化进行概述。对203 个差异代谢物进行评估后识别出了9 种表达模式Sub Class 1～9（图7）。其中占比最高的Cluster 5（占总体22%）随生长阶段变化不断积累，在竹笋快速生长期含量显著增加，主要是酚酸类（44%）和脂质（16%）表现出这种聚类；第2大类群Cluster 9，包括38 种代谢物，在S2～S3阶段含量显著积累，主要是脂质（32%）、酚酸（16%）、有机酸（13%）和氨基酸及其衍生物（11%）。此外，Cluster 6和7主要包含黄酮、脂质和部分氨基酸，在竹笋生长过程中呈现下降趋势，只在S1期显著富集。

图7 DAMs表达模式热图（A）和K-means图（B）Fig.7 Heatmap (A) and K-means plots (B) of DAM expression patterns

为了更直观展示代谢物的总体差异情况，通过FC值计算，绘制代谢物含量差异动态分布图，标注其中上调和下调前10 个代谢物。如图8所示，随着竹笋生长，S2相比S1阶段显著上调物质有S-烯丙基-L-半胱氨酸、L-酪胺、松香酸和苯基乙醇胺以及多个酚酸类物质，下调的物质有12-羟基氢化松香酸甲酯、褪黑激素、新绿原酸和多个黄酮类物质如槲皮素-3-O-芸香糖苷（芦丁）、槲皮素-7-O-芸香糖苷等。而在S2生长到S3过程中，芹菜素、肉桂酸和9-(阿拉伯糖基)次黄嘌呤等含量显著增加，色胺、顺-N-阿魏羟色胺、1-氨基环丙烷-1-羧酸、甘磷酸胆碱GPC等显著下降。可以看到显著变化的差异代谢物中，上调类物质以酚酸为主，下调类物质S1 vs S2以黄酮为主，S2 vs S3以生物碱为主，其中也有多个氨基酸和脂质类物质发生变化。结合聚类分析结果，发现毛竹笋生长动态变化的差异代谢物主要集中在脂质类、氨基酸类、有机酸类、酚酸类以及黄酮和生物碱类化合物。

图8 不同生长时期代谢物含量差异动态分布Fig.8 Dynamic distribution of differences in metabolite contents at different growth stages

2.4.1 脂质类化合物

脂质是人体重要的营养素之一，能够供给机体所需的能量和脂肪酸[23]。脂质还是酯类化合物合成的前体代谢物，竹笋中已有研究表明酯类是主要的风味物质之一[24]。毛竹笋中共检测到37 个差异累积脂质（图9），其中多数脂质随生长高度的增加相对含量呈上升趋势，其中以溶血磷脂酰乙醇胺类表现的最为显著，这类物质与促进果实成熟、提高果实品质稳定性及延缓植物组织衰老密切相关[25-26]。但也有例外，甘油酯类、甘磷酸胆碱GPC以及部分游离脂肪酸均在竹笋S1阶段显著富集，在S2～S3阶段显著下降（图8、9）。其中甘磷酸胆碱GPC是一种水溶性磷脂代谢产物，具有降脂健脑等多种功效[27]。

图9 差异累积脂质在竹笋生长中的变化情况Fig.9 Variation of differentially accumulated lipids during bamboo shoot growth

2.4.2 氨基酸及其衍生物

竹笋中氨基酸含量丰富，能够提供人体所需的17 种氨基酸[22,28-29]。通过靶向代谢组测定，发现毛竹笋中有22 种氨基酸及其衍生物在不同生长阶段出现显著差异（图10）。不同阶段差异显著氨基酸包含L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-高甲硫氨酸和L-精氨酸，其中L-天冬氨酸、L-缬氨酸与L-精氨酸在S1期显著富集，L-谷氨酸与L-高甲硫氨酸在S2具有较高的表达水平。而对于氨基酸衍生物，5-氧化脯氨酸、N-甲酰-L-蛋氨酸、N-α-乙酰基-L-鸟氨酸等在S1期显著富集，N-单甲基-L-精氨酸、S-烯丙基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸等在S2期显著富集，L-酪胺、谷胱甘肽还原型、γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸等在S3期显著富集。在竹笋高生长中，天冬氨酸和谷氨酸作为鲜味氨基酸，其相对含量在S1和S2表达量高，说明竹笋在S1、S2阶段鲜味特征明显[30-31]。而谷胱甘肽代谢通路中谷胱甘肽还原型及其前体化合物γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸含量在S1到S3阶段含量不断增加，表明在S3期毛竹笋的谷胱甘肽氧化型向还原型转化，该阶段毛竹笋的抗氧化性提高。

图10 差异累积氨基酸及其衍生物在竹笋生长中的变化情况Fig.10 Variation of differentially accumulated amino acids and their derivatives during bamboo shoot growth

2.4.3 有机酸类化合物

有机酸是一类具有羧基的化合物，在植物中的有机酸可作为碳源、增强植物抗性、影响氨基酸合成、抑菌等[32-33]。毛竹笋中多数有机酸在竹笋生长的S2、S3期具有较高表达（图11），如1-氨基环丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸、苯丙酮酸、琥珀酸和苹果酸等。柠檬酸、异柠檬酸、奎宁酸和α-酮戊二酸等除外，在S1、S2期含量维持较高水平，S3期含量最低。其中1-氨基环丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸都与乙烯合成有关[34]，苯丙酮酸是木质素合成途径的前体化合物[35]。此外，有机酸中琥珀酸、柠檬酸、异柠檬酸、酮戊二酸等都是三羧酸循环的中间产物，随着竹笋生长高度增加，琥珀酸、苹果酸呈上调趋势，而柠檬酸、异柠檬酸、酮戊二酸与之相反，从S1～S3积累水平不断下降。

图11 差异累积有机酸在竹笋生长中的变化情况Fig.11 Variation of differentially accumulated organic acids during bamboo shoot growth

2.4.4 酚酸类化合物

植物性食物中的酚酸类化合物在维持人体健康方面表现出多种益处，具有优异的抗氧化、抗炎、调节胆固醇等功能[36-39]，酚酸主要通过果蔬和谷物摄入，而竹笋是一种富含儿茶素、咖啡酸、绿原酸等酚酸类物质的植物性食物[40-41]。毛竹笋中检测到了大量的酚酸类物质（图12），多数在竹笋S2～S3阶段相对含量较高，如苯甲酸、芥子醇、松柏醇、肉桂酸、熊果苷。但三羟基肉桂酰奎宁酸、丁香酸、新绿原酸、2-氨基-3-甲氧基苯甲酸、苯甲酰胺和2-苯乙醇这6 个酚酸例外，在S1期表达量显著高于S2与S3期。其中在毛竹笋生长期与快速生长期，作为木质素合成前体的松柏醇、芥子醇，以及能够提高植物耐受性的苯甲酸、肉桂酸等酚酸相对含量显著提高，新绿原酸相对含量显著降低，表明竹笋快速生长期部分功能性成分减少，但许多酚酸与增强环境适应能力密切相关。

图12 竹笋不同生长阶段酚酸类化合物的差异累积Fig.12 Differential accumulation of phenolic acids in bamboo shoots at different growth stages

2.4.5 黄酮和生物碱类化合物

黄酮类化合物对生物体代谢调节有重要作用，可以起到清除自由基、抗肿瘤、抗癌、抑菌等作用[42]，因此近年来，黄酮的生物活性开始在食品行业中被应用[43-44]。许多研究表明竹笋中含有丰富的黄酮类化合物[45-46]。通过代谢组学测定，发现毛竹笋中的黄酮主要以黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、黄酮碳糖苷的形式存在（图13A），在竹笋的生长过程中，多数黄酮在S1期显著富集，S2期显著降低，槲皮素-3-O-半乳糖苷（金丝桃苷）、异金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（异槲皮苷）、槲皮素-3-O-芸香糖苷（芦丁）、柚皮素、紫铆素等均表现出下降趋势。然而，香叶木素、麦黄酮、沙可林B、水仙苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷和芹菜素及其下游代谢物牡荆素在S3期含量显著增加。

生物碱类物质是植物中的重要活性成分，且其含量变化与调节植物生长和应对环境胁迫密切相关[47]。毛竹笋中共监测到生物碱17 种，其中有6 种在S2～S3阶段变化极为显著（图13B），对香豆酰基腐胺、色胺、N-阿魏酰五羟色胺和顺-N-阿魏羟色胺相对含量显著下降，褪黑激素含量显著上升。其中色胺是褪黑激素合成途径的上游代谢物，说明快速生长期消耗大量色胺用于合成褪黑激素。褪黑激素能够协同多种植物激素调控植物生长发育，提高植物应对胁迫的能力[48]。

3 结论

本研究通过广泛靶向代谢组学分析方法结合生理指标测定，对毛竹笋不同生长阶段的成分进行了鉴定。研究结果显示，毛竹笋随生长高度增加黄度值和硬度值均显著增加，与此同时，口感相关指标如木质素和纤维素含量显著上升，糖类、蛋白质、游离氨基酸等决定竹笋营养品质的指标显著下降，竹笋总酚、黄酮和VC含量在3 个生长阶段中也呈现下降趋势，隶属函数分析表明毛竹笋破土期具有较好的营养风味品质。进一步对不同生长期的代谢物分析，共鉴定出765 个化合物，其中有203 个代谢物出现差异累积，并通过热图对毛竹笋差异代谢物的动态变化情况进行全面分析。结果表明多数黄酮类（芦丁等）、游离脂肪酸（9-羟基-12-氧代-10E,15Z-十八碳二烯酸等）、氨基酸（天冬氨酸、精氨酸等）以及少量酚酸（新绿原酸等）富集在破土期，这些化合物可能与毛竹笋的风味和营养品质密切相关。大部分脂质类（溶血磷脂乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱等）、氨基酸衍生物（谷胱甘肽还原型、L-酪胺等）、有机酸类（苯丙酮酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸等）、酚酸类（芥子醇、肉桂酸等）以及褪黑激素随生长高度增加相对含量呈上升趋势，说明尽管毛竹笋生长期与快速生长期风味品质降低，但依旧含有丰富的功能活性物质，而且这些化合物可能与增强竹笋抗性、促进生长发育密切相关。本研究通过代谢组学方法阐述了毛竹笋不同生长阶段主要差异代谢产物的动态变化，为毛竹笋的营养价值研究以及毛竹资源的开发与利用提供理论依据。