高效液相色谱法测定果味葡萄酒中甜蜜素

◎ 刘 骞，沈 菁，刘 军，陈 鑫，程运斌

（湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农产品营养品质与安全湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064）

葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的酒精度不低于7.0%vol的发酵酒。葡萄酒中含有多种氨基酸、水溶性维生素以及多种抗氧化物质，有助于人们抵御心血管疾病，预防在血管中形成血栓，促进血液循环等功效[1]。为了去除葡萄酒在发酵过程中产生的苦味并增加回甜的口感，会向葡萄酒中加入一定量的甜蜜素，但是甜蜜素过量添加会导致果味葡萄酒存在一定的饮用安全风险[2]。

甜蜜素是一种通过人工化学合成的甜味剂，其化学名称为环己基氨基磺酸钠，其甜度为蔗糖的30～40 倍，被广泛应用于食品加工中。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760ü 2014）中明确规定，在蒸馏酒和发酵酒中均不得添加甜蜜素，而在配制酒中可以适量添加甜蜜素，但最大使用量不超过0.65 g·kg-1[3]。近年来，甜蜜素滥用的现象经常发生[4]，如果长期食用甜蜜素含量超标的食品，会对人体的健康造成危害。马麟莉等[5]研究表明过量的甜蜜素会对人体的肝脏、神经系统、泌尿系统及生殖系统造成不良影响，因此建立一种简便快捷检测甜蜜素含量的方法是保障食品安全的有效途径之一。目前，检测甜蜜素的常用方法有气相色谱法[6-7]、高效液相色谱法[8-11]和高效液相色谱串联质谱法[12-15]。高效液相色谱串联质谱法因为质谱仪本身价格昂贵，还易受样品基质的干扰，适用范围窄；气相色谱法需要先对甜蜜素进行衍生反应，该反应是一个低温反应，不易把控甜蜜素的衍生化率，导致检测结果的稳定性不好；液相色谱法虽然也需先对甜蜜素进行衍生反应，但是该反应是一个简单的常温反应，容易控制甜蜜素的衍生化率，从而获得稳定的检测结果。因此本试验通过优化高效液相色谱法，建立了一种简便、快速有效检测果味葡萄酒中甜蜜素含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

日式果味葡萄酒，超市购买；乙腈和正庚烷为色谱纯；硫酸、次氯酸钠、氢氧化钠和碳酸氢钠，均为分析纯试剂，其中次氯酸钠溶液需要保持有效氯含量在50 g·L-1以上；甜蜜素标准品（10 mg·mL-1，农业农村部环境保护科研监测所）；实验用水为新制备的超纯水。

1.1.2 仪器

SHIMADZU LC-10AD 高效液相色谱仪；Inertsil ODS-3 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Milli-Q超纯水仪器；电子天平；恒温水浴锅；旋涡混合器，IKA；精密移液枪，Transferpette；过滤头（滤膜孔径约为0.22 μm）。

1.2 液相色谱条件

流动相为乙腈-水体系（70 ∶30，V∶V），流速为1.0 mL·min-1；柱温为40 ℃；检测波长为314 nm；进样体积为10 μL，由甜蜜素转化的N,N-二氯环己胺的保留时间为15 min。

1.3 样品前处理及衍生方法

称取5.0 g 果味葡萄酒样品于小烧杯中，用氢氧化钠溶液调至弱碱性（pH 为7～8）再放入恒温水浴锅中以60 ℃加热30 min 除去样品中的酒精，放冷后用水定容至10.0 mL 备用。将上述样品全都转移到分液漏斗中，先加入2.0 mL 硫酸溶液（硫酸与水的体积比为1 ∶1），再加入次氯酸钠溶液（有效氯含量50 g·L-1以上）1.0 mL，振荡摇匀1 min，静置反应10 min，然后加入正庚烷5.0 mL，剧烈振荡1 min，静置分层，除去水层后在正庚烷层加入25.0 mL 碳酸氢钠溶液（50.0 g·L-1），振荡1 min，静置取上层有机相经0.22 μm 滤膜过滤，滤液上机备用。

1.4 标准工作曲线的制备

准确移取浓度为10 000.0 mg·L-1的甜蜜素标准溶液1.0 mL，用水定容至10.0 mL 配制成甜蜜素标准储备液1 000.0 mg·L-1。准确移取甜蜜素标准储备液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL 和2.0 mL 于10.0 mL容量瓶中定容配制成浓度为10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1和200.0 mg·L-1的标准溶液。将上述配制的一系列标准溶液按照1.4 中的处理方法进行衍生化（标准溶液不需要进行去除酒精步骤）得到标准工作曲线。

1.5 计算方法

样品中甜蜜素含量的计算公式为

式中：X为样品中甜蜜素的含量，g·kg-1；c为由标准曲线计算出样品定容溶液中甜蜜素的浓度，mg·L-1；V为样品溶液最后定容体积，mL；m为样品的质量，g。计算结果保留3 位有效数字。

2 结果与分析

2.1 衍生化试剂的加入顺序

《食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定》（GB 5009.97ü 2016）中衍生化试剂的加入顺序为硫酸、正庚烷和次氯酸溶液，剧烈振荡1 min 后静置分层。检测环己基氨基磺酸钠的原理是将食品中环己基氨基磺酸钠用水提取后，在强酸性溶液中与次氯酸钠反应，生成N,N-二氯环己胺，再用正庚烷萃取后，可用高效液相色谱仪检测，环己基氨基磺酸钠的衍生化反应是一个在水相中的反应，如果在加入次氯酸钠之前就加入正庚烷会不利于环己基氨基磺酸钠与次氯酸钠的反应，导致反应转化率降低，上样后仪器响应值低，降低检测灵敏度。因此，在本次试验中衍生化试剂的加入顺序改为先加入硫酸溶液酸化提取体系，再加入次氯酸钠充分反应，最后再加入正庚烷萃取环己基氨基磺酸钠的衍生产物。不同的衍生化试剂加入顺序的色谱图见图1、图2。

图1 50 mg·L-1 甜蜜素标样色谱图（衍生化试剂加入顺序依次为硫酸、正庚烷和次氯酸钠）

图2 50 mg·L-1 甜蜜素标样色谱图（衍生化试剂加入顺序依次为硫酸、次氯酸钠和正庚烷）

2.2 标准工作曲线的线性范围

分别对甜蜜素系列标准溶液（10 mg·L-1、20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1）进行上机测定。以峰面积为纵坐标，甜蜜素浓度为横坐标绘制标准曲线，见图3。从标准曲线上得出衍生后的甜蜜素标准溶液的峰面积与浓度在10～200 mg·L-1呈线性关系，其线性回归方程为y=175 709x-11 744.7，相关系数为0.998 0，检出限为0.003 g·kg-1，定量限为0.01 g·kg-1（10 倍信噪比），该方法可用于外标法定量甜蜜素的含量。

图3 甜蜜素衍生物的标准曲线图

2.3 果味葡萄酒样品的测定

在1.3 的色谱条件下上机测定果味葡萄酒样品中甜蜜素的含量，见图4、图5。果味葡萄酒样品中不含有甜蜜素衍生物，因此果味葡萄酒样品中未检出甜蜜素，基线比较平稳，没有其他杂峰干扰。

图4 添加了甜蜜素的果味葡萄酒样品色谱图（添加水平为0.2 g·kg-1）

图5 果味葡萄酒样品色谱图

2.4 方法的准确度和精密度

称取果味葡萄酒样品5.00 g，向样品中加入一定量的甜蜜素标准溶液，使样品中甜蜜素的含量分别为0.03 mg·g-1、0.06 mg·g-1、0.20 mg·g-1。分别平行测定5 次，测定数据见表1，结果表明该果味葡萄酒样品的加标回收率为88.9%～101.0%，相对标准偏差为2.15%～6.23%。

表1 甜蜜素在果味葡萄酒中的添加回收率结果表

3 结论

本试验建立并优化了检测果味葡萄酒中甜蜜素的方法，相关系数为0.998 0，检出限为0.003 g·kg-1，定量限为0.01 g·kg-1，样品加标回收率为88.9%～101.0%，相对标准偏差为2.15%～6.23%。该方法准确度和精密度均达到国标中检测分析要求。此方法前处理操作简单，衍生化反应稳定、重现性好，适用于检测果味葡萄酒或者类似酒类样品中甜蜜素的含量。