淡水产品及其暂养水中丁香酚类化合物风险研究

◎ 万素琴，王多娇，颜春荣，徐春祥，周 雪，张金秋

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210000）

丁香酚是一种常见的有机化合物，由于其自身具有一种浓郁的香味，常常被用作香料应用于各种精油中，还可作为一种食用香料使用。丁香酚学名4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，分子式为C10H12O2，在常温下主要呈现油状液态，颜色为淡黄色和透明色，密度为1.06 g·cm-3，熔点为-10 ℃，沸点高达254 ℃，微溶于水且完全溶于部分有机溶剂。丁香酚化学结构如图1所示。

图1 丁香酚化学结构图

丁香酚价格低廉且具有良好的麻醉效果，常作为水产品的麻醉剂，并广泛应用于鲜活水产品的养殖、运输等领域，其安全性及残留控制等问题引发了诸多关注。当前国际相关领域认为将丁香酚用于水产品的麻醉具有一定的风险，欧洲食品安全局认为丁香酚达到一定含量会对生物的皮肤和视力产生影响；美国食品药品管理局对于丁香酚的使用有非常严格的规定，明令禁止在水产品中出现丁香酚，被划分为第3 类致癌物；部分东亚和大洋洲国家对于丁香酚的应用很开放，日本规定丁香酚的最高残留量（Maximum Residue Limit，MRL）设定为0.05 mg·kg-1，但规定了丁香酚的休药期，甲壳类休药期为10 d；新西兰规定了丁香酚的最大残留限量为0.1 mg·kg-1[1-3]。我国尚无明确的法规规定丁香酚类化合物可以作为水产麻醉剂使用，仅在GB 2760ü 2014 中规定丁香酚可作为食品级香料，但在水产品的使用却没有明确的规定。本实验对市售淡水产品进行检测，通过科学、有效的监测方式对淡水产品及暂养水中存在的丁香酚类化合物的种类、含量进行分析。同时对丁香酚类化合物在水产品中的残留量进行了动态监测，使用鱼用麻醉剂对鲜活鲫鱼进行麻醉给药实验，观察麻醉效果以及残留量消除情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、顺式-甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯和乙酰基异丁香酚（DR.E）；淡水鱼（农贸市场）；乙腈、正己烷、二甲亚砜（色谱纯，MERCK）。鱼用麻醉剂（农贸市场和网络采样）。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2020 岛津气相色谱-质谱联用仪（配有电子轰击电离源）；7890B-7000D 安捷伦气相色谱-质谱联用仪（配有电子轰击电离源）；XW-80A 旋涡混合器（上海医大仪器有限公司）；SL16R 高速离心机（美国赛默飞公司）；氮吹仪（tegent）；电子天平（METTLER）；增氧泵。

1.3 实验方法

1.3.1 动态监测麻醉给药实验

市场自购鲫鱼40 条，分成3 组，分别为空白对照组和2 个不同浓度丁香酚给药组。低浓度长时间：丁香酚给药浓度20 mg·L-1时，麻醉时长10 h；高浓度短时间：丁香酚给药浓度100 mg·L-1，麻醉时长为5 min。用水冲洗后在放入复苏空白池开始计时，在0 h、0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、12.0 h、24.0 h和48.0 h进行取样，观察记录鲫鱼复苏存活情况。观察记录鱼体的外观和脏器变化，同时按照实验样品处理步骤对其体中丁香酚类的含量进行测定，具体实验流程见图2。

图2 丁香酚麻醉实验流程图

1.3.2 样品前处理

称取2.0 g 磨碎的鱼腹部位鱼肉样品（去鳞、去头、去内脏）于50 mL 离心管中，加入一个陶瓷均质子、5 g无水Na2SO4和10 mL 乙腈，超声20 min，8 000 r·min-1离心3 min，收集上清液，以同样的方法重复提取一次，合并上清液，加入5 mL 乙腈饱和的正己烷，涡旋1 min，8 000 r·min-1离心8 min，弃去上清液，然后加入50 μL 二甲基亚砜，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，涡旋0.5 min，有机相滤膜过滤，采用气相色谱-质谱联用仪测定6 种丁香酚类化合物的含量。

称取5 g淡水产品的暂养水样于50 mL离心管中，加入10 mL 乙腈，涡旋5 min，加入5 g 无水MgSO4和一个陶瓷均质子，继续涡旋5 min，然后5 000 r·min-1离心5 min，准确移取4 mL 上清液于50 mL 离心管中，加入50 μL 二甲基亚砜，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈，涡旋30 s，有机相滤膜过滤，采用气相色谱-质谱联用仪测定6 种丁香酚类化合物的含量。

1.3.3 仪器条件

（1）气相色谱参数。色谱柱：VF-1701（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：柱温初始为90 ℃，保持2 min，然后以5 ℃·min-1升至210 ℃，再以20 ℃·min-1升至250 ℃，保持1 min；载气：高纯氦气；流速：1.0 mL·min-1；进样口温度：230 ℃；进样模式：不分流进样；进样量：1 μL。

（2）质谱参数。电离方式：电子轰击电离源（EI）；EI 能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟：6.00 min；采集方式：离子监测。

2 结果与分析

2.1 市售淡水鱼及暂养水结果分析

通过对市售淡水鱼进行暂养并测定，检出丁香酚，色谱图见图3。同时选取空白基质样品，在不同浓度的水中暂养并进行测定，实验室暂养水检出浓度最高为24 mg·kg-1。检出样品中，草鱼重量为1.98 kg，检出丁香酚为8.3 mg·kg-1；鲫鱼重量为0.65 kg，检出丁香酚为0.043 mg·kg-1，说明丁香酚残留量与鱼体本身品种和个体大小有关，随着鱼体增大，其耗氧量也随之增加，鱼用麻醉剂检出量也随之增加。

图3 阳性鲫鱼样品SIM 模式下质谱图

影响丁香酚代谢残留的因素主要是鱼的品种、个体大小以及不同的给药方式，其他影响因素有温度、湿度、盐度、pH 值等。有研究表明，提升水温能够很好地控制麻醉和复苏时间，使水产品的代谢率得到显著提升[4-6]。

2.2 市售麻醉剂结果分析

对6 种采购的鱼用麻醉剂进行质谱扫描并和NIST库比对，其匹配度最高的化合物都为丁香酚（图4）。

图4 1 μg·mL-1“渔夫宝”麻醉剂质谱图

2.3 丁香酚对鲫鱼的麻醉效果观察及残留消除研究

丁香酚对鱼的麻醉给药实验表明，低浓度的麻醉和苏醒耗时长，高浓度麻醉和苏醒耗时短，复苏率均为100%，且48 h 存活率依旧不变。给药复苏后的鲫鱼与空白对照组比较而言，鱼体本身无肉眼可见变化，但活力相较于空白对照鱼明显变弱，鱼体黏液减少；鱼鳞明显变松，内脏颜色变深。高剂量组可能因麻醉效果快、在药水中浸泡时间短，内脏颜色相较于低剂量组略浅，但给药组总体比空白组内脏颜色加深，结构上也呈松散状态。

不同麻醉方式下丁香酚在鲫鱼肉中的残留情况如图5 所示。结果显示，鲫鱼低浓度长时间麻醉后鱼肉中富集丁香酚的最高浓度为31.9 mg·kg-1，高浓度短时麻醉后鱼肉中富集的最高浓度为11.4 mg·kg-1；表明高浓度快速麻醉实验下鲫鱼体内丁香酚残留量低于低浓度长时间麻醉下的鲫鱼。不同浓度的给药实验后复苏的鲫鱼体内丁香酚残留量持续减少，2～4 h 消除最快。4 h 后残留消除率明显降低。低浓度长时间麻醉实验组和高浓度短时麻醉实验组在清水中复苏24 h 后残留量分别为1.8 mg·kg-1和2.4 mg·kg-1，48 h 后鲫鱼体内丁香酚残留量明显降低且趋于平衡，但最低含量仍有0.078 mg·kg-1。因此，需要全面考量不同的影响因素，为休药期的设定提供可靠依据，持续动态监测市场上水产品麻醉剂的使用。

图5 不同给药浓度下丁香酚在鲫鱼体内残留情况图

3 结论与讨论

丁香酚类化合物是市场上常见的鱼用麻醉剂的主要成分，由于水产品在运输的过程中极易受到水温、水密度、颠簸或者拥挤等因素的影响，导致耗氧量提升、呼吸代谢加快、二氧化碳排放量升高，使得水产品应激、感染、死亡[7-9]。因此，水产市场上常用麻醉保活的方式提高水产品的存活率。

丁香酚类化合物在鱼中的残留自消除规律的研究结果表明，高浓度短时麻醉残留量低且不影响鲫鱼的复苏率和存活率，建议在实际运输中选择高浓度短时麻醉的方式。高浓度短时麻醉下，48 h 后丁香酚的残留含量仍有0.078 mg·kg-1，需要进一步研究丁香酚类化合物在鲫鱼中的代谢规律，确定更合理的用药量、用药时间和休药期。残留在鱼肉中的丁香酚类化合物可能会危害人体健康，应尽快制定相关的风险评估、制定相关法律法规和标准，以及相应的快检方法，保障消费者的健康。