饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼消化酶、免疫酶以及抗氧化酶的影响

付 旭， 张 璐， 姜志强， 韩雨哲，张德洪， 王武刚， 尹 恒， 米海峰

（1.通威农业发展有限公司水产研究所，四川 成都 610093；2.大连海洋大学，辽宁 大连 116023；3.农业农村部水产畜禽营养与健康养殖重点实验室，四川 成都 610093；4.水产健康养殖四川省重点实验室，四川 成都 610093）

叶黄素分子式为C40H56O2， 又称植物黄体素， 是由8 个异戊二烯为单位所组成的含有2 个羟基的共轭烯烃，是一种无维生素A 活性的类胡萝卜素（孟哲和刘红云，2007）。

王军波等（2004）在叶黄素与免疫功能的研究中提出， 叶黄素可以促进抗原刺激后的淋巴细胞的增殖，并且影响细胞表面分子的功能性表达，来达到促进细胞免疫的效果； 叶黄素还可以通过增加B 细胞亚群数量、增强抗体反应以及促进血浆免疫球蛋白水平的形式来增强体液免疫反应；叶黄素可以增强氧化酶的活性和巨噬细胞细胞色素氧化酶，并对巨噬细胞活性也具有促进作用，由此可以增强巨噬细胞突发性呼吸作用， 使巨噬细胞可以更有效的对微生物和外源性抗原物质起到杀灭作用， 从而达到增强生物体非特异性免疫的作用；在亚细胞结构中，叶黄素的存在可以防止免疫细胞被氧化损伤，以保证完好的细胞功能，使其更好的发挥免疫功能，此外，叶黄素还可以通过调节细胞间通讯和细胞膜流动性来影响免疫功能。 孙振等（2005）在收集充分的试验实例得出结论显示叶黄素具有抗癌的作用。 Aman 等（2005）发现，叶黄素分布在视网膜黄斑部和晶状体中，具有光保护性和抗氧化性，吸收大量蓝光，通过物理或化学淬灭作用灭活单线态氧， 清除自由基来保护视神经，对视网膜功能起到决定性作用。

淡黑镊丽鱼隶属鲈形目，慈鲷科，镊丽鱼属，又名非洲王子，体色为柠檬黄色，背鳍、胸鳍和臀鳍边缘有一条黑色的条带， 其野生属身上会带有部分黑色杂斑。 淡黑镊丽鱼最大体长为8 ～10 cm，最长寿命7 ～10 年，最适水温为23 ～28 ℃，最适水体pH 为7.5 ～8（城市渔夫和诺言，2006）。淡黑镊丽鱼属于观赏价值较高的观赏鱼， 目前鲜有针对淡黑镊丽鱼的各方面研究，需要进行拓充。本试验将以淡黑镊丽鱼作为研究对象， 探讨饲料中叶黄素水平对淡黑镊丽鱼消化酶、 抗氧化酶及免疫酶活力造成的影响， 为开发淡黑镊丽鱼人工养殖使用的配合饲料提供相关理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本试验所使用淡黑镊丽鱼为当地养殖场自行繁育。 体长 （4.7±0.1）cm， 体质量（1.70±0.09）g。

1.2 试验饲料的制备 试验饲料原料由大连龙源海洋生物有限公司提供， 经过充分的粉碎、过筛、搅拌混合后，通过小型颗粒料制粒机制粒，置于60 ℃烘箱进行烘干， 成品于-20 ℃冰箱避光、真空密封保存。糖源由淀粉等物质提供，蛋白源由豆粕及鱼粉提供，脂肪源由大豆油（益海嘉里食品营销有限公司，上海）提供。 DZ（对照组）、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，6 组分别添加4%叶黄素（石家庄绿川生物有限公司）0、1、2、5、10、40 g/kg， 并用纤维素进行调平，纤维素添加量分别为175、145、115、83、5 g/kg，试验饲料组成及营养成分含量见表1，混合维生素和混合矿物质配方参考王莉苹等（2017）。

表1 试验饲料营养成分含量（干物质基础）

1.3 试验设计及饲养管理 取状态良好、体态差异小的淡黑镊丽鱼144 尾， 随机平均分成6 个试验梯度，即DZ（对照组）、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，分别投喂添加4%叶黄素（石家庄绿川生物有限公司）0、1、2、5、10、40 g/kg 的饲料， 对应实测叶黄素含量依次为20.57、58.68、86.04、167.72、310.60 mg/kg和1090.41 mg/kg，作为6 个试验组，每个试验组设计3 个平行组，各平行组放置8 尾试验鱼，整个试验置于控温循环水系统（大连汇新钛有限责任公司，大连）中进行，循环水流量3 L/min，养殖水体体积30 L。 各组随机布置于此系统中，共18 个循环水槽。 水温恒定于25.0 ℃，每日分别于8：00和16：00 进行表观饱食投喂， 投喂1 h 后清理粪便及杂质，每日18：00 换水，换水量为20%，保持水质良好稳定，每日光照12 h。 气泵充气保持氧气充足（DO≥7.0 mg/L）。 试验共进行68 d。

1.4 试验取样以及方法 试验取样及方法参照付旭等（2017）操作方法。试验期间观察鱼的生长、发育、摄食及死亡情况。 试验结束并停食24 h 后，随机于各平行组中取6 尾试验鱼， 至于冰袋上，纱布擦干体表水分后，使用无菌解剖工具解剖并取其完整的肠道及肝脏。将各平行组所取全部试验鱼的肠道样品进行混样处理用于检测消化酶等相关指标，肝脏样品进行混样处理用于检测抗氧化酶及免疫酶等相关指标，放入对应组别的离心管内，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱短暂储存，样品加入预冷的生理盐水并于0 ℃无菌操作环境下充分匀浆制成20%的匀浆液， 于4 ℃、2500 r/min 离心10 min 后取上清，再稀释成所检测的不同种酶的最适检测浓度进行测试。 匀浆液在8 h 内完成测试。

1.5 指标测定与计算 采用试剂盒（南京建成生物有限公司），对过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、 谷胱甘肽过氧化物酶 （GSHPX）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC）、淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶（PRS）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、乳酸脱氢酶（LDH）和溶菌酶（LZM）、谷丙转氨酶（ALT/GPT）和谷草转氨酶（AST/GOT）进行测定，并对结果进行分析。

1.6 数据统计方法 所得数据均采用 “平均值±标准误”表示，并采用SPSS 20.0 分析软件进行方差齐次检验和单因素方差分析 （One-Way ANOVA），并进行Duncan 氏多重比较， 显著性水平设置为0.05。

2 结果

2.1 饲料中叶黄素含量对淡黑镊丽鱼消化能力的影响 如表2 所示， 伴随淡黑镊丽鱼摄入的叶黄素的增加，AMS 活力试验组均高于DZ 组，且除Y3 外其余各试验组均与DZ 组有显著差异 （P＜0.05），Y5 出现最大值；PRS 活力Y5 组显著高于其他各试验组和DZ 组（P＜0.05），除Y5 组外其他各组均无显著差异（P＞0.05）；LPS 活力各组间均无显著差异 （P＞0.05）， 其中Y2 组出现最低值，Y5 组出现最高值，且高于DZ 组两倍。

表2 饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼肠道消化酶活力的影响

2.2 饲料中叶黄素含量对淡黑镊丽鱼免疫能力的影响 如表3 所示， 伴随淡黑镊丽鱼摄入叶黄素水平的提高，AKP 呈先升后降趋势，除Y1 组和Y2 组外其余三组均低于DZ 组，且Y3 组和Y5 组显著低于DZ 组、Y1 组和Y2 组 （P＜0.05）；ACP呈下降趋势，ACP 各试验组均低于DZ 组， 并且Y4 组达到最低值，且显著低于DZ 组（P＜0.05）；LZM 各组之间均无显著差异，各组之间数值较平稳（P＞0.05）； LDH 各组间无显著差异，且数值之间无规律（P＞0.05）。

表3 饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼肝脏免疫酶活力的影响

2.3 饲料中叶黄素含量对淡黑镊丽鱼抗氧化能力的影响 如表4 所示， 伴随淡黑镊丽鱼摄入叶黄素水平的提高，CAT、GSH-PX、T-SOD 和TAOC 均呈先升后降趋势。 其中对T-AOC 活力的影响表现为所有组之间均无显著差异， 但于Y2组出现最大值（P＞0.05）；对T-SOD 活力的影响表现为Y1 组出现最大值，并与除Y5 组外的所有组有显著差异性 （P＜0.05），Y4、Y5 组显著高于DZ 组（P＜0.05），并且所有试验组均高于DZ 组；对CAT 活力的影响表现为Y3 组出现最高值并与Y4 组和Y5 组差异显著（P＜0.05），Y5 组显著低于Y2 组和Y3 组 （P＜0.05）， 各试验组均与DZ组无显著差异（P＞0.05）；对GSH-PX 活力的影响表现为Y1 组显著高于其余各组（P＜0.05），除Y3 组与DZ 组无显著差异外（P＞0.05），其余各组之间均存在显著差异性（P＜0.05）；MDA 则呈先降后升并于Y3 组开始趋于平稳的趋势， 并且所有试验组均低于DZ 组， 并于Y2 组出现最小值，且与Y3 组和DZ 组产生显著差异（P＜0.05）。

表4 饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼肝脏抗氧化酶活力的影响

3 讨论

3.1 饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼消化能力的影响 陈进树等（2009）对鱼类消化酶的研究中提出， 消化酶作为对食物分解吸收必不可少的酶，对鱼类生长发育起关键作用。不同食性、品种以及处于不同发育时期的鱼类的消化酶活力均有差异，生存环境如温度、pH 等也会影响消化酶活力。 摄入饵料等外源物质同样对消化酶有影响。消化酶活力反映了鱼类对营养物质的消化吸收能力，从而决定了鱼类生长发育的性能。目前，类胡萝卜素对鱼类消化酶影响的研究相对较少，其中张芬等（2017）对小丑鱼（Amphiprioninae）的研究发现，小丑鱼的胃肠部的消化酶活性受虾青素的影响较为明显，且在一定范围内，随着摄入虾青素量的增加，其LPS、PRS 和AMS 的活力升高，且均高于对照组。本试验所得结果表示，高叶黄素摄入对淡黑镊丽鱼的AMS 和PRS 起到了促进的作用。在摄入低浓度叶黄素时试验组的PRS和LPS 与DZ 组均差异不显著，但在最高叶黄素浓度组中，PRS、LPS 以及AMS 均与DZ 组相差较多，且PRS 与AMS 差异显著，故试验证明淡黑镊丽鱼大量摄入叶黄素（1090.41 mg/kg）时会促进PRS 与AMS 的活力。

3.2 饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼免疫酶活力的影响 磷酸酶又称为磷酸单酯水解酶， 是可催化各种含鳞化合物水解的酶类， 根据最适pH 分为AKP 和ACP。 唐林等（2006）提出，磷酸酶与动物机体的骨化作用有关。 詹付凤等（2007）报道，AKP 通过调节体内磷钙代谢从而影响鱼类的生长发育，ACP 作为溶酶体的标志酶之一， 反映细胞消化过程。何海琪等（1992）提出，磷酸酶干预生物对营养物质的消化、吸收和转运。本试验以肝脏做匀浆测得的高浓度叶黄素摄入组的淡黑镊丽鱼，AKP 和ACP 显著低于DZ 组， 肝脏具有解毒作用， 故表现为叶黄素摄入量过高会造成淡黑镊丽鱼肝脏受到损伤，使其解毒功能减弱，或影响其免疫能力。陈艳等（2009）阐述LZM 为正常机体免疫防御机制的组成部分， 其在机体内溶解体内细菌细胞壁，从而起到杀菌作用。本试验结果表明淡黑镊丽鱼肝脏中的LZM 活力不受摄入叶黄素浓度的影响， 从而证明摄入叶黄素的量对抵抗体外入侵的细菌的能力没有影响。 陈思翀等（2008）阐述LDH 是在细胞内催化乳酸氧化成丙酮酸，其组织中的浓度高于血液中的活力，当肝脏、肾脏以及肌肉组织中的细胞结构发生非正常大量破损时，其活力会受到影响。 本试验随着淡黑镊丽鱼摄入叶黄素量的增加，LDH 没有改变， 说明体内没有发生其所述的组织细胞大量破损。

3.3 饲料叶黄素水平对淡黑镊丽鱼抗氧化能力的影响 Chew 等（2004）表示，叶黄素是一种良好的抗氧化剂，可以捕获自由基、猝灭单线态氧，防止自由基破坏生物膜。 Beckman 等（1997）同样表示， 叶黄素发挥其生物活性的作用机理是通过猝灭活性氧族达到对活性氧自由基的活性抑制的作用， 从而起到保护正常细胞不被活性氧自由基破坏的效果。 苏卿等（2014）在对叶黄素的研究中发现， 叶黄素因其抗氧化性能而被广泛应用于各个领域，但叶黄素具有抗氧化和促氧化的双重作用，其通过体外的化学方法和脱细胞彗星试验表明叶黄素的含量过高或者过低时会表现出促氧化作用， 但在生物体内的抗氧化和促氧化作用未作研究。 故本试验旨在探究叶黄素对淡黑镊丽鱼抗氧化能力的最适添加量。 水产动物肉质腐败的主要原因是脂类物质的氧化，MDA 是脂类物质的氧化产物， 是衡量脂类氧化程度的重要指标（Scaife等，2015）。 本试验的试验组MDA 均低于DZ 组，说明叶黄素对淡黑镊丽鱼的脂类氧化起到了抑制作用， 故证明试验中添加叶黄素对淡黑镊丽鱼体内产生了抗氧化作用。 在Zhang 等（2013）对虹鳟的研究中发现， 饲料中添加100 mg/kg 的虾青素时，虹鳟血清中的CAT 和T-SOD 显著降低，肌肉中的MDA 显著降低，肝脏中的T-AOC 提高。 在赵鑫鑫等（2016）对虹鳟、金鱼以及锦鲤受类胡萝卜素影响的研究中得出，饲料中分别添加100 mg/kg的叶黄素、虾青素、雨生红球藻以及角黄素均使金鱼肝脏中的T-AOC 升高，MDA 降低，得出这四种添加剂对金鱼抗氧化酶活性有提升的作用。 在阿伦等（2009）于叶黄素对鹌鹑（Coturnix）的影响研究中发现， 饲料中添加叶黄素其子代鹌鹑血清的各个抗氧化酶活性于14 d 时均低于对照组，并差异显著， 于21 d 测得则与对照组差异不显著，其解释为子代鹌鹑体内的叶黄素发挥抗氧化作用与抗氧化酶共同清除活性氧自由基， 从而使抗氧化酶活性降低，随着母源性叶黄素被逐渐消耗，叶黄素起到的抗氧化作用比例降低， 使得自身的抗氧化酶活力恢复。结合以上试验的结果，本试验中添加少量叶黄素时对淡黑镊丽鱼自身的抗氧化酶活力起到促进作用，故各抗氧化酶活力高于DZ 组，MDA 低于DZ 组。 当叶黄素添加量继续升高时抗氧化酶活力被促进的同时， 部分叶黄素开始协助抗氧化酶分解自由基，此时抗氧化酶活力高于DZ组， 但部分抗氧化酶活力较最高值降低，MDA 含量在此时含量达最低值。 当叶黄素添加量继续升高时，叶黄素开始承担大部分分解自由基的功能，使抗氧化酶活力显著降低，但MDA 低于DZ 组并保持相对稳定状态。

4 结论

本试验结果表明， 黑镊丽鱼大量摄入叶黄素（1090.41 mg/kg） 时会促进PRS 与AMS 的活力。叶黄素摄入量≥167.72 mg/kg 时， 会降低磷酸酶活力，或为淡黑镊丽鱼肝脏受损所致，使其解毒功能减弱， 或影响其免疫能力。 适当摄入叶黄素（58.68 ～86.04）mg/kg 时，可以增加淡黑镊丽鱼的抗氧化能力。