透明质酸钠组合物对小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用

张霞，宋永民，冯晓毅，郭学平*

华熙生物科技股份有限公司（济南 250014）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种以慢性间歇性肠道炎症为特征的炎症性消化系统疾病，其可因环境因素、遗传易感性、肠道上皮屏障功能损伤或肠道菌群的免疫反应受损而恶化[1]。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的主要类别之一，其主要症状为呕吐、腹泻、腹痛、直肠出血以及体重减轻等，严重降低了UC患者的生活质量[2]。目前，UC主要是通过5-氨基水杨酸盐、免疫抑制剂、糖皮质激素和生物制剂等药物治疗，然而药物治疗会表现出一些副作用，如过敏反应、药物依赖性和肝毒性[3]。因此，在不损害个人生活质量的情况下预防和控制UC的替代和补充疗法受到了人们的重视和青睐。其中，采用温和、功效持久稳定、无副作用或副作用很小的天然活性物质缓解UC症状的治疗方法也越来越受到人们的关注。

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种线性糖胺聚糖，由重复的N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸双糖单位组成[4]。国家卫健委批准的HA用于普通食品的形式为其钠盐，即透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）。HA是构成细胞外基质的重要成分，主要在大部分软结缔组织中起着重要的生理功能，包括肠道。有研究表明，HA可以维持肠道通透性，增强肠道免疫力，减少肠道感染[5]。Mao等[6]研究发现补充外源性透明质酸增加了小鼠对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）的耐药性，并能够减轻肠道炎症状。从而，通过口服HA改善UC成为值得关注的一种手段。

文章通过构建小鼠溃疡性结肠炎模型，考察SH分别与乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）、菊粉（inulin，INU）及维生素C（vitamin C，VC）复配对肠道的保护功效，为以HA为主要天然活性物质缓解UC的治疗方式提供应用基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物和试剂

SPF级C 57 BL/6 J小鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司），生产许可证号：SCXK（鲁）20190003，动物使用许可证号：SYXK（鲁）20180031，雄性，1～2月龄，体重约20±5 g，动物合格证号：NO.370726221100437887。动物饲养和处理遵循中国实验动物科学协会实验动物福利和伦理委员会规定。动物饲养室温度20～26 ℃，湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。

透明质酸钠（分子量：2 190 kDa，华熙生物科技股份有限公司）；乳清分离蛋白（杭州科田生物技术有限公司）；菊粉（广东雅惠生物科技有限公司）；维生素C（河南天得商贸有限公司）；葡聚糖硫酸钠（分子量：4万，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE染色剂（珠海贝索生物技术有限公司）；甲醛水溶液和石蜡（江苏世泰实验器材有限公司）。

1.1.2 仪器和设备

UW 2200 H型电子天平（日本岛津公司）；Tissue-Tek®PrismaTM型全封闭组织脱水机（日本樱花公司）；TK-218型摊烤片机（湖北泰维医疗器械有限公司）；NP-B型生物组织包埋机（湖北诺普医疗器械有限公司）；RM 2235型切片机（德国Leica公司）；尼康E 100生物显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及模型的构建

健康雄性C 57 BL/6 J小鼠，SPF级，20±5 g，50只，按体重将其随机分为5组：空白对照组（Control）、模型组（DSS）、SH+乳清分离蛋白组（SH+WPI），SH+菊粉组（SH+INU），SH+维生素C组（SH+VC），每组10只。

空白对照组的小鼠在28 d期间都饮用纯水。模型组小鼠在28 d内用纯水灌胃，在第22～第28天期间饮用含质量分数为2.50% DSS的纯水溶液，用以建立溃疡性结肠炎小鼠模型；其他SH组合物组小鼠在28 d内灌胃相应同体积的供试品溶液，在第22～第28天饮用含质量分数2.50% DSS的纯水溶液。各试验组的灌胃剂量及质量浓度见表1，按照0.20 mL/10 g体积给小鼠进行灌胃。透明质酸钠的用量为人体推荐摄入量200 mg/d的10倍。

除空白对照组外，各个试验组在22～28 d间，每2 d更换1次DSS溶液。在试验第28天下午全部小鼠禁食，第29天对小鼠实施安乐死。

1.2.2 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评估

通过溃疡性结肠炎模型建立后每天记录的临床症状表现进行肠道疾病活动指数评估。体重减轻（0：无；1：减少1%～5%；2：减少5%～10%；3：减少10%～15%；4：减少＞15%）、大便稠度（0：正常；2：稀便；4：水样腹泻）和血便情况（0：正常；2：轻微出血；4：严重出血）三项的总和，作为肠道疾病活动指数的衡量标准。

1.2.3 结肠长度测定

试验结束后，对小鼠进行安乐死处理，迅速剖开腹腔，分离小鼠结肠，测量盲肠末端至肛门整个肠段的长度。

1.2.4 结肠组织病理学检测

取距肛门处2 cm的结肠组织，置于质量分数10%中性甲醛溶液浸泡固定，常规石蜡包埋切片，进行HE染色，最后通过光学显微镜观察肠黏膜的病理变化，并进行组织病理学评分。隐窝结构的破坏（0～4：无损伤、基底三分之一损伤、基底三分之二损伤、仅表面上皮完整、整个隐窝和整个上皮丢失）、病变深度（0～3：无、黏膜、黏膜下、透壁）和炎症细胞浸润的程度（0～3：无、轻微、中度、严重）三项的总和，作为组织病理学评分。

1.3 统计分析

文章数据均以表示，使用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料采用单因素方差分析（ANOVA）或T检验，评分资料采用秩和检验（Mann-WhitneyU检验）。所有图均采用GraphPad Prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 SH组合物对溃疡性结肠炎小鼠DAI值的影响

DAI评分是UC模型建立成功的标准之一。参照试验记录，空白对照组小鼠体重变化轻微，精神状态及活动量正常，而其他各组小鼠在给予DSS后逐渐出现体重减轻、精神不振、活动量下降、腹泻等现象。这种现象与孙晶晶等[7]的研究中描述一致。从图1可以看出，小鼠以质量分数2.50% DSS溶液自由饮用期间，与空白对照组相比，模型组小鼠DAI评分显著升高（P＜0.05），表明小鼠溃疡性结肠炎模型形成。与模型组相比，经SH+WPI、SH+INU和SH+VC干预后，小鼠DAI评分分别降低了26.42%，35.85%和33.96%，说明三组SH组合物具有减轻由DSS引起的溃疡性结肠炎症状的趋势。

2.2 SH组合物对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响

小鼠结肠萎缩是UC的重要特征之一[8]。从图2可以看出，与空白对照组相比，DSS组的结肠长度萎缩了1.15 cm（P＜0.05），说明小鼠UC模型建立成功。同时，经SH+WPI、SH+INU干预后，小鼠结肠长度分别缩短了0.52 cm、0.14 cm，而SH+VC组的结肠更长，增加了0.51 cm，肠内容物为健康的黑色状态，说明口服这三种SH组合物能显著抑制小鼠结肠长度缩短（P＜0.05），有效改善UC的结肠萎缩。吴铭等[9]的研究中，经紫色菜蔬乙醇提取物干预后的小鼠结肠长度较模型组小鼠显著增长，得出其能够有效抑制DSS导致结肠炎小鼠结肠萎缩情况的结论，该试验结论与文章研究类似。

图2 SH组合物对结肠炎小鼠结肠长度的影响

2.3 SH组合物对溃疡性结肠炎小鼠肠道组织病理的影响

肠道组织学改变和结肠黏膜损伤是UC的病理表现特征[10]。从图3可以看出，空白对照组小鼠的结肠黏膜杯状细胞及腺体隐窝结构完整，且排列整齐，没有炎性细胞浸润，而模型组小鼠结肠黏膜杯状细胞丢失，腺体隐窝结构破坏，伴有炎性细胞浸润。这与Lü等[11]用DSS对小鼠构建UC模型后的结肠组织病理学变化一致。SH+INU组、SH+VC组小鼠的结肠黏膜损伤有一定程度减轻，腺体隐窝排列趋于整齐，上皮结构较完整，炎性细胞浸润减少。同时，根据图4小鼠结肠组织病理学评分，对比模型组，SH+INU组小鼠结肠病理评分降低了43.18%，SH+VC组小鼠结肠病理评分降低38.64%（P＜0.05）。病理结果表明，SH+INU具有改善小鼠结肠组织损伤的趋势，SH+VC可明显改善DSS诱导的小鼠结肠组织损伤。

图3 各组小鼠结肠组织HE染色

3 讨论

溃疡性结肠炎因其慢性、复发、高发病率等特性，已成为世界范围内主要的健康问题之一[12]。患有溃疡性结肠炎的人，其免疫反应被激活，肠道通透性增加，肠道黏膜屏障结构及肠道微生物群的稳态被破坏，从而激活更严重的免疫反应，导致疾病复发[13]。透明质酸是一种糖胺聚糖聚合物，已被证明在胃肠道的稳态中发挥重要作用。透明质酸在肠道炎症疾病中具有抗炎和富集微生物的作用[14]。同时，有研究表明透明质酸主要通过维持肠道屏障防御和功能来预防肠道细菌感染和减少肠道炎症[5,15-18]。菊粉是一种天然果聚糖，其作为益生元可以改善肠道中菌群的结构与组成，以及加强肠黏膜屏障作用，从而发挥对炎症性肠病的有效影响[19]。乳清蛋白为常见蛋白补充剂之一，其主要组成成分为免疫球蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等。乳清蛋白含有蛋氨酸与半胱氨酸，能够抑制机体的氧化应激以及改善肠道中致病菌群的相对丰度，最终发挥保护肠道屏障的功能[20]。维生素C具有强大的氧自由基清除能力，其能够通过抑制炎症细胞浸润，调节炎症因子等多种途径抑制炎症反应[21]。同时，维生素C可以增强肠道黏膜的屏障功能[22]。

基于此，文章将透明质酸钠分别与菊粉、乳清分离蛋白、维生素C进行复配，研究不同SH组合物对溃疡性结肠炎的缓解作用。文章采用质量分数2.50%DSS溶液对小鼠造成溃疡性结肠炎模型，与模型组对比，各SH组合物组小鼠的DAI值增长缓慢，结肠长度均显著延长（P＜0.05），同时，SH+INU、SH+VC组小鼠的结肠黏膜损伤有一定程度减轻，腺体隐窝排列较整齐，上皮结构较完整，炎性细胞浸润减少，且SH+VC组小鼠结肠病理评分显著降低（P＜0.05）。

4 结论

综上所述：透明质酸钠分别与乳清分离蛋白、菊粉、维生素C复配均可发挥对小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用，其中，透明质酸钠与维生素C复配的效果更为明显。此研究结果为透明质酸钠及其组合物在缓解溃疡性结肠炎方面的应用提供了理论依据。