不同分子量的透明质酸钠及其组合物对酒精性胃黏膜损伤的保护作用

王猛，冯晓毅，宋永民，郭学平*

华熙生物科技股份有限公司（济南 250000）

胃是消化系统重要组成部分，在营养吸收中起关键作用，胃病的发生常与胃黏膜损伤密切相关[1]。胃黏膜受到外界因素侵害时，黏膜上皮会发生损伤和再生，产生炎症反应，导致胃黏膜功能受损。酗酒、高压力、幽门螺旋杆菌感染、急性/慢性胃炎、长期使用非甾体抗炎药等[1]都会导致胃黏膜损伤。研究表明，乙醇直接接触胃黏膜会造成损伤，30 min时开始出现，60 min出现高峰，且呈剂量关系[2]。

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种人体内本身存在的生物活性物质，主要以透明质酸钠（sodium hyaluronate，SH）的形式广泛存在于皮肤、关节、眼睛等组织器官中，起补水保湿[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]等作用。研究报道，HA在口腔黏膜、皮肤黏膜、胃黏膜、膀胱黏膜具有良好的辅助保护作用[6-8]。正常情况下，黏膜组织是抵御细菌入侵和传播的有效屏障；在屏障被破坏时，具有宏观聚集活性的HA分子可以帮助重建该屏障[9]。因此，HA被认为是最具有前景的生物活性物质之一[10]，在2020年，被国家卫健委列入新食品原料类目中，可添加到普通食品中。刘磊等[10]报道1 000 kDa的HA对不同致病因素导致的大鼠胃黏膜损伤均有辅助保护作用，能够减少损伤面积，改善组织病理变化。Al-Bayaty等[11]研究表明含有240 mg/100 g的高分子量HA凝胶具有更好的辅助保护作用，但具体分子量不明。

因此，为进一步考察透明质酸钠对胃黏膜的辅助保护作用，探究不同分子量透明质酸钠对胃黏膜辅助保护效果，在此基础上，分别与维生素C、罗伊氏乳杆菌组合，通过建立酒精性胃黏膜损伤大鼠模型并进行口服干预研究，为HA及其组合物在胃黏膜保护领域研究及食品开发提供新思路和科学参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂

SPF级SD雄性大鼠，6～7周龄，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号SCXK（鲁）20190003；动物饲养和处理遵循中国实验动物科学协会实验动物福利和伦理委员会规定。

SH（平均分子量分别为400 kDa和2 190 kDa，华熙生物科技股份有限公司）；维生素C（Vitamin C，VC，河南天得商贸有限公司）；灭活罗伊氏乳杆菌DSM17648[Lactobacillus reuteri，LR，诺维信（中国）生物有限公司]。

1.2 试验仪器

LE203E-02电子天平[精度0.1 mg，梅特勒-托利多（上海）有限公司]；Tissue-TekRVIPR6全封闭组织脱水机（日本樱花公司）；NP-B生物组织包埋机（湖北诺普医疗器械有限公司）；RM2235切片机（德国Leica公司）；尼康E100生物显微镜（日本Nikon公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 动物饲养与分组

SPF级大鼠喂养于山东省药学科学院新药评价中心，温度维持在20～26 ℃，日温差≤4 ℃；湿度40%～70%；昼夜明暗交替时间12 h/12 h；期间大鼠自由进食饮水。5 d适应期结束后，根据体重随机分组，每组10只，体重约190～225 g，按体重随机分组，每组2笼共10只，分别在头、颈、背、尾、左前腿位置处标识。

国家卫健委2020年第9号公告显示，新食品原料HA人体推荐食用量≤200 mg/d（约合3.33 mg/kg），参考《保健食品检验与评价技术规范》中“保健食品功能评价的基本要求”和《辅助保护胃黏膜检验方法》关于受试样品剂量和时间的要求。每日灌胃1次，连续30 d，模型组、对照组给予纯水。试验剂量设计见表1。

表1 剂量分组表

1.3.2 酒精性胃黏膜损伤模型建立

每天经口给予0.5 mL/100 g受试样品，模型组、对照组同时给予等体积的纯水，定期称量体重。于末次给药后24 h禁食不禁水。所有受试动物灌胃给予1.0 mL/只无水乙醇，并在1 h后处死，暴露完整胃，结扎幽门，灌注适量10%甲醛溶液，固定20 min后沿胃大弯剪开，洗净内容物，展开胃黏膜，并用游标卡尺测量出血点或出血带的长度和宽度，作胃黏膜损伤评分。

1.3.3 肉眼观察评定

胃黏膜损伤程度以损伤发生率（%）、损伤积分指数和损伤抑制率表示，按式（1）～（4）计算，评分标准见表2。

表2 酒精性胃黏膜损伤肉眼观察评分标准

式中：因宽度所代表损伤的严重性高于长度，故双倍积分。

1.3.4 病理组织学观察及评分

切下每只动物胃黏膜中损伤最严重的部位，用10%甲醛溶液固定，常规制片，经HE染色，观察包括黏膜全层的区域。

以充血、出血、黏膜细胞变性坏死在整个黏膜上皮层的累及程度为标准，将损伤分为5级。充血权重为1，出血权重为2，上皮细胞变性坏死权重为3，病变总积分按式（5）计算，评分标准见表3。

表3 酒精性胃黏膜损伤镜下评分标准

病变总积分=充血积分+出血积分×2+上皮细胞变性坏死积分×3 （5）

1.3.5 统计分析

数据以“平均数±标准差”表示。采用SPSS 16.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA）或T检验，评分资料采用秩和检验（Mann-Whitney U检验），P＜0.05认为有统计学意义。

2 试验结果

2.1 SH及组合物对大鼠体重的影响

由表4可知在4周的试验周期内，各组大鼠之间体重稳定增长且无显著差异，外观体征和活动未见异常，不存在生病中毒死亡个例现象。口服SH及组合物对大鼠安全。

表4 4周内受试物对大鼠体重的影响

2.2 SH及组合物对酒精性胃黏膜损伤观察评分

如表5和图1所示，与正常组相比，各试验组的大鼠胃黏膜损伤发生率为100%，均产生酒精性胃黏膜损伤，出血点及出血带明显，满足建模要求。受试物的口服干预，对胃黏膜酒精性损伤有不同的抑制效果，体现为损伤积分降低，出血点、出血带有不同程度减少；HSH组的损伤抑制效果要优于LSH组，损伤积分为31.9±12.4，与模型组存在极显著差异，说明高分子量SH的保护作用强于低分子量SH，这与Al-Bayaty研究趋势一致[11]。HSH-VC组和HSH-LR组皆对酒精性胃黏膜损伤有显著保护作用，其中SH与VC复配的HSH-VC组保护效果最强，损伤抑制率达42.7%。

图1 SH及组合物对酒精性胃黏膜损伤外观观察

表5 SH及组合物对酒精性胃黏膜损伤大体观察结果

2.3 SH及组合物对酒精性胃黏膜损伤病理观察

在图2可以看出：大鼠胃黏膜组织的HE病理结果趋势与外观观察趋势一致；与模型组相比，各试验组的病变总积分均降低，说明SH及组合物均对胃黏膜具有预防保护作用；其中，HSH-VC组病变积分最低，辅助保护效果最优，与模型组呈极显著差异（P＜0.01）。

图2 SH及组合物对酒精性胃黏膜损伤病理观察结果

如图3所示：健康大鼠的胃黏膜F组组织呈光滑细腻状，色泽正常，细胞排列明显有序，不存在出血现象；模型组E组出现充血、出血现象，细胞排列疏散，黏膜细胞肿胀，这在刘磊等[10]研究中得到印证；试验组（A～D）经过口服干预后，组织形态整体色泽趋于正常，出血现象减轻，与LSH组（A）相比，HSH组、HSH-VC组与HSH-LR组的黏膜组织损伤减轻，说明高分子量SH的辅助保护作用强于低分子量SH；结合图2病变积分结果，HSH-VC的损伤积分最低，具有更好的胃黏膜辅助保护作用。

图3 SH及复配物对酒精性胃黏膜损伤HE切片观察

3 讨论

乙醇致胃黏膜损伤包括直接损伤和其代谢产物造成的损伤。乙醇是一种有机溶剂，与水互溶，会破坏胃黏膜的黏液层，打破胃黏膜屏障正常生理平衡，损伤黏液细胞；乙醇在代谢过程中产生的乙醛，会使蛋白质变性，加剧胃黏膜损伤，甚至增大胃癌的发生率。胃黏膜上皮和血管内皮损伤产生的炎性介质可以导致中性粒细胞浸润，产生大量活性氧，高度富集的活性氧降低抗氧化酶活性，抑制胃溃疡愈合，从而加剧损伤[7,14]。

一方面，高分子量的透明质酸会降低胃运动，通过使胃褶皱变平，建立一个机械屏障，形成保护层，减小乙醇刺激的胃黏膜收缩压力；限制活性氧中间体进入细胞表面，减少DNA损伤，NF-kB和半胱天冬酶激活[11]，达到预防保护作用。另一方面，在黏膜组织溃疡愈合的关键过程中，HA可参与调控上皮细胞分化、促进上皮细胞形成和黏膜水化[15]；HA分子中的羟基官能团能与乙醇产生的活性氧（超氧阴离子）和自由基结合，达到清除目的。

组合物中的VC是一种水溶性抗氧化剂，能够与HA协同清除活性氧、自由基，降低胃丙二醛含量[16]，阻碍1-羟乙基的形成[17]。减少胃黏膜中的脂质过氧化，从而保护胃微循环。VC刺激胃上皮细胞中抗氧化剂和血管扩张剂血红素加氧酶的表达，抑制诱导型一氧化氮合酶[18]的表达，一氧化氮可以影响肌肉张力及外分泌和内分泌功能[19]。同时VC可参与抗体和胶原的形成，促进损伤后的愈合和维持正常的细胞生长、复制过程和神经再支配作用[20]。罗伊氏乳杆菌是一种耐胃酸、对黏膜存在很强黏附性的乳酸杆菌。研究表明，罗伊氏乳杆菌可以在胃肠道中定植[21]，参与免疫反应，降低瞬时电位感受器香草醛受体1染色强度，恢复胃黏膜抗氧化参数（谷胱甘肽、超氧化物歧化酶）的正常水平[13]，在体内外均能抑制幽门螺杆菌。

4 结论

试验通过口服SH及SH组合物对乙醇诱导的急性胃黏膜损伤大鼠进行干预，结果表明高分子量SH及组合组均具有胃黏膜辅助保护作用，其中HSH-VC保护作用更为显著，可以更好地改善胃黏膜组织形态，减缓损伤程度。试验结果可为SH在胃黏膜保护领域的食品、药品开发提供新的思路和依据，但其对胃黏膜保护的作用机理仍需进一步探究。