槲皮万寿菊素对AFB1 损伤肉鸡肝脏的保护作用及生产性能的影响

潘奎，石玉祥

（河北工程大学食品工程与生命科学学院，河北 邯郸 056000）

黄曲霉毒素（AF）是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌合成产生的拥有双呋喃环及氧砸萘邻酮（香豆素）结构的真菌毒素[1]。目前已发现20 多种黄曲霉毒素，主要分为G1、G2、B1、B2、M1、M2 六种类型[2]。其中AFB1 毒性最强，已于1993 年被国际癌症研究机构（IARC）归类为1 类致癌物[3]。因其对动物的强毒性作用，成为研究最为深入的真菌毒素之一。其对机体的损害可表现为致癌性、致畸性、诱变性、免疫抑制，严重威胁畜禽的健康及食品安全。AFB1 在动物机体内经CYP450 酶系代谢，P450 酶系主要产生于肝细胞[4]。因而导致了AFB1 对肝脏的特殊亲和性。且动物摄入AFB1 后，大部分通过十二指肠吸收再经过门静脉途径蓄积于肝脏[5]。故肝脏成为AFB1 损伤的最主要器官。

槲皮万寿菊素是近年来新开发的黄酮类化合物，具有提高生产性能、抗氧化等多种功效[6，7]。研究发现，一些天然植物提取物能有效缓解AFB1 对肝脏的损害作用[8，9]。但目前未见槲皮万寿菊素对AFB1 及其他真菌毒素致动物肝脏损伤的保护性研究，此研究领域是一个空白。本实验参考前人研究构建AFB1 损伤肉鸡模型[10]，研究槲皮万寿菊素对AFB1 损伤肝脏的保护作用及生产性能的影响，为畜禽养殖中实际应用槲皮万寿菊素及新型饲料添加剂研发提供理论依据。

1 材料

1.1 主要材料

AFB1，麦克林试剂有限公司；槲皮万寿菊素，晨光生物有限公司；黄芪多糖，华畜兽药有限公司；AST 试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司；ALT 试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；二甲苯，国药集团化学试剂有限公司；石蜡，Leica；H.E 染色试剂盒，北京中科万邦生物科技有限公司；中性树胶封片剂，北京中科万邦生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

离心机，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司DM0424；酶标仪，迈瑞MR-96A；脱水机，武汉俊杰电子有限公司JT-12S；包埋机、冻台，武汉俊杰电子有限公司JB-P7；石蜡切片机，德国LeicaRM2235；组织摊片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-P；烤片机，常州国华电器有限公司DB-B2；烤箱，邦西仪器科技（上海）有限公司101-1BS；倒置显微镜及成像系统，日本尼康；数字切片扫描系统，宁波江丰生物信息技术有限公司KFPRO-120。

2 方法

2.1 污染饲料的配制

将20 mg AFB1 溶于10 mL 甲醇溶液中，均匀喷洒在饲料中，风干。

2.2 试验设计

选取108 只1 日龄，体重相近，健康状况良好的三黄鸡。按照随机分组试验设计，分为6 个组，每组3个重复，每个重复6 只鸡。对照组饲喂基础日粮，其他试验组在基础日粮基础上添加2.8 mg/kg AFB1、2.8 mg/kg AFB1＋200mg/kg 槲皮万寿菊素、2.8 mg/kg AFB1＋400 mg/kg 槲皮万寿菊素、2.8 mg/kg AFB1＋600 mg/kg 槲皮万寿菊素、2.8 mg/kg AFB1＋600 mg/kg黄芪多糖，连续饲喂7 d 后更换为对照组饲喂基础日粮、200 mg/kg 槲皮万寿菊素、400 mg/kg 槲皮万寿菊素、600 mg/kg 槲皮万寿菊素、600 mg/kg 黄芪多糖，连续饲喂至21 d。常规免疫，不限制雏鸡饲料饮水，试验第1 周的饲养温度控制在33～35 ℃，之后根据鸡群状态和活动表现，每周下降2～3 ℃，直至到26 ℃。整个试验过程当中，湿度控制在60%～70%。

2.3 样品采集

试验第21 d，各组每个重复各选2 只鸡进行翅下静脉采血0.5 mL，3000 r/min 离心10 min，分离血清，冻存于-20 ℃冰箱等待检测。样品鸡屠宰后，分别取出肝脏组织，称重后，用4%多聚甲醛浸泡固定48 h。

2.4 生产性能指标的测定

试验第21 d，称量肉鸡体重，整个试验周期以重复笼计算采食量。肝脏称重后，计算器官指数。计算公式如下：

2.5 病理的测定

2.5.1 石蜡切片的制备

（1）取材固定：肝脏取材后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。

（2）脱水：将组织块依次放入75%、85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇溶液中浸泡45 min。

（3）透明：脱水后的肝组织浸泡于二甲苯溶液25 min，更换二甲苯溶液再浸泡25 min 进行置换。

（4）浸蜡：透明后的组织浸泡于65℃蜡液中3 h进行置换组织中的二甲苯。

（5）包埋：把浸蜡后的组织水平放在包埋盒中心，将熔化后的石蜡缓慢倒入包埋盒，待石蜡凝固后，用刀修成长方体小块。

（6）切片：用切片机匀速连续地切片，厚度4 μm，将切片放入40 ℃水浴锅中展平，待切片无皱折后，用黏附载玻片将切片取出。

（7）烘片：将附有切片的载玻片放在37 ℃烘片机上烘干。

2.5.2 H-E 染色

（1）脱蜡：将烘干固定的切片浸泡于二甲苯溶液10 min 后，再更换二甲苯溶液浸泡10 min 置换出切片石蜡。

（2）水化：经两次无水酒精洗去二甲苯溶液，每次5 min，然后依次经95%、90%、80%、70%酒精进行水化，各5 min，蒸馏水洗去酒精。

（3）苏木精染色：将切片浸泡在苏木素染色液中5 min，用流水冲洗25 min；再将切片放入1%盐酸酒精中浸泡1 min，蒸馏水水洗。

（4）返蓝：将切片浸泡在氨水中2 min，蒸馏水水洗。

（5）伊红染色：切片浸入伊红染色液4 min后，用流水冲洗1 min。

（6）脱水：切片依次经70%、80%、90%、95%及两份无水酒精进行脱水，各2 min。

（7）透明：切片脱水后，浸入二甲苯I（5 min）、二甲苯II（10 min）进行透明。

（8）封片：将已透明的切片滴上树脂胶，用盖玻片封固。

（9）观察：待树脂胶干后，在光学显微镜下观察肉鸡肝脏组织病理变化

2.6 AST、ALT 的测定

将采集的血液3000 r/min 离心收集血清，按照试剂盒说明进行检测天门冬氨酸氨基转移酶（AST）与谷草转氨酶（ALT）。

3 结果与分析

3.1 槲皮万寿菊素对染毒肉鸡生产性能的影响

由表1 可知，在整个试验期间，与对照组相比，饲喂AFB1（2.8 mg/kg）污染饲粮组的肉鸡平均日增重与肝指数显著降低（P<0.05），料重比显著升高（P<0.05）。而饲喂槲皮万寿菊素或黄芪多糖的肉鸡平均日增重、肝指数、料重比均有一定程度改善。槲皮万寿菊素及黄芪多糖均能提升肉鸡平均日增重，其中高剂量槲皮万寿菊素组及黄芪多糖组较模型组具有显著性差异（P<0.05）。对于染毒造成的肉鸡料重比升高，低中高剂量槲皮万寿菊组及黄芪多糖组均有一定程度的降低，但无显著性差异。低中高剂量槲皮万寿菊素组及黄芪多糖组也能提高AFB1引起的肝指数降低，其中高剂量槲皮万寿菊素组及黄芪多糖组肉鸡肝指数较模型组具有显著性差异（P<0.05），而低中剂量槲皮万寿菊素组较模型组不具有显著性差异。

表1 肉鸡生产性能统计

3.2 槲皮万寿菊素对染毒肉鸡肝脏病理的影响

对肝脏进行切片HE 染色后，镜下观察肝脏组织病理学变化。图2 所示，对照组肝脏结构正常，肝小叶结构完整，排列整齐。模型组可见肝小叶结构紊乱，肝细胞索不明显，肝细胞空泡变性严重，坏死崩裂、门管区纤维组织增生，并从血管区向周围延伸。较模型组比较，黄芪多糖组及槲皮万寿菊素低中高剂量组肝细胞空泡变性减轻，血管区纤维增生减轻。结果表明，槲皮万寿菊素可明显改善由AFB1引起的肝脏病理变化，对肉鸡肝脏具有一定的保护作用。

图2 肉鸡肝脏组织病理结果（150×）

3.3 槲皮万寿菊素对染毒肉鸡血清AST、ALT 的影响

天门冬氨酸氨基转移酶（AST）与谷草转氨酶（ALT）是存在于肝细胞的两种酶类。当肝细胞遭受损伤，细胞膜通透性改变，血液中AST、ALT 明显升高。因此，我们通过测定血清中的AST、ALT 水平，来评判槲皮万寿菊素对AFB1 所致肉鸡肝脏损伤的影响。图3 所示，模型组肉鸡血清AST、ALT 酶活性显著高于对照组（P<0.05），表明饲喂AFB1 肉鸡肝脏细胞遭受损伤。与模型组相比，低中高槲皮万寿菊素组及黄芪多糖组AST、ALT 显著性降低（P <0.05）。这表明，槲皮万寿菊素对AFB1 引起的肉鸡肝脏损伤具有一定的改善作用。

图3 槲皮万寿菊素对染毒染毒肉鸡血清中AST、ALT 的影响

4 讨论

AFB1 可降低生长速度、饲料转换效率和增加疾病发病率、死亡率，对家禽业造成巨大的经济损失。本研究显示了连续7 d 饲喂2.8 mg/kg AFB1 对肉鸡生长性能的毒性作用。这些结果与以往的研究结果一致[2]。这些不良反应可以解释为AFB1 造成的畜禽蛋白质合成和脂肪生成的抑制有关。

肝脏是AFB1 损害的主要靶器官。饲喂AFB1的肉鸡肝脏指数显著降低，表明肝脏肿大，而饲喂AFB1 饲粮同时饲喂槲皮素能改善肉鸡肝脏指数。与血清生化变化相关的研究结果表明，与对照组相比，受2.8 mg/kg AFB1 污染的饲粮显著增加了AST、ALT 酶的活性（P<0.05）。AST 和ALT 的升高可能是由于坏死或细胞膜通透性的改变导致的肝细胞的破坏。这些结果与之前的研究结果一致[11]。而添加槲皮万寿菊能改善这一结果。在黄曲霉毒素的生物转化过程中，它产生大量的活性代谢物，这些代谢物与DNA、蛋白质等大分子结合，破坏肝脏结构，造成肝脏细胞空泡变性严重，门管区纤维组织增生并向四周弥漫生长。饲粮中添加200、400、600 mg/kg 水平的槲皮万寿菊素显著改善了AFB1引起的肝脏病理改变。

5 结论

饲粮中添加槲皮万寿菊素能显著改善AFB1引起的肉鸡肝脏损伤，提高生产性能。为开扩槲皮万寿菊素的新应用及新型饲料添加剂的研发提供了试验依据。