戊型肝炎病毒基因3 型衣壳蛋白与Huh-7 细胞互作蛋白的筛选

梁 鹏，宋阳冉，连瑞雅，陈轶霞，李慧霞

（ 1. 西北民族大学生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030 ； 2. 西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030 ）

HEV基因3型中ORF2蛋白参与调节病毒的复制和增殖、装配及与宿主蛋白互作，由于HEV的体外增殖困难且HEV 模式动物也是近年来的研究热点，因而发掘与ORF2互作的宿主蛋白指导动物模型的构建仍具有一定的科学意义。基于此，本研究利用免疫共沉淀和蛋白质谱分析技术，结合生物信息学分析，筛选与ORF2蛋白相互作用的宿主蛋白，为探索动物与宿主之间的靶蛋白与ORF2 的互作及其参与HEV感染提供兽医公共卫生的预警体系，实现动物HEV的常态跟踪和防控。

1 材料与方法

1.1 试剂与抗体

Not I 和Nhe I 两种限制性内切酶、高保真酶PrimeSTAR premix、T4-DNA连接酶和感受态细胞DH-5α均购自Takara公司；高敏ECL发光底物、5×转膜缓冲液膜购自Bio-rad 公司；Lipofectamine 3000 购自Invitrogen 公司；Myc-Tag Mouse mAb鼠单克隆抗体购自生工生物工程（上海）公司；GAPDH 鼠多单克隆抗体购自北京全式金生物技术股份有限公司；银染试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；pCAGEN-myc空载、HEV Kernow C1/P6和Huh-7细胞均由生物工程与技术国家民委重点实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 ORF2真核表达载体的构建与鉴定

以HEV Kernow C1/P6基因为模板，设计针对ORF2全长的特异性引物ORF2-F：5'-GTTGAGCAGAACCCGAAGAG-3'（下划线为Not I 酶切位点），ORF2-R：5'-CGGGCTCAGTCAAGTAAAGC-3'（下划线为Nhe I 酶切位点）。PCR 反应体系（50 μL）：ORF2-F 1 μL、ORF2-R 1 μL、PrimeSTAR premix(2X) 25 μL、P6 质粒2 μL、DEPC水21 μL。

反应程序参照PrimeSTAR premix说明书推荐条件，利用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。限制性内切酶Not I和Nhe I 分别酶切pCAGEN-myc 空载和PCR 回收产物，37℃，7～8 h；将两种酶切产物分别回收后，利用T4 DNA Ligase进行连接反应：4 ℃、12 h；之后按照感受态使用说明书，将连接产物转化至DH-5α中，涂板至氨苄青霉素抗性细菌平板上，37 ℃、12～16 h；挑取单克隆菌落，依次进行菌液PCR鉴定和双酶切鉴定，阳性菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.2 Huh-7细胞转染与表达鉴定

用10% FBS-DMEM 培养的Huh-7 细胞，经胰酶消化后，以4×105个细胞/孔铺至6 孔板中，待细胞密度生长至70%～80%，用Lip3000 转染ORF2 重组质粒（2 μg/孔），36～48 h 后离心收细胞，NP40 细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂PMSF），冰上裂解20 min，低温，12 000 g离心15 min，转移上清，加入5×Loading Buffer，煮样5 min，进行SDSPAGE 和Western blotting，Myc 标签抗体用于检测重组质粒是否正确表达。

1.2.3 免疫共沉淀分析

想要让学生的家长不担心学生的学习成绩，那么就需要教师能够先给学生安排合理的时间，要让学生学会合理地分配自己的业余时间，能够让学生学习足球技巧和学习理论知识两个都不耽误，并让学生在成绩稳定的情况下，和学生家长协商，适当参加足球活动，并让学生家长能正确地看待体育教学，了解体育教学的重要意义。还可以向学生家长介绍足球的价值，不仅能够锻炼身体，还能够培养学生之间的团结力,是学生发展“德、智、体、美、劳”方面的重要基础。

按上述操作方法进行细胞转染，收集Huh-7 细胞，获得细胞裂解上清；按照Protein G Agarose 使用说明书进行Co-IP 试验，取10μL Protein G Agarose，加入5 μL Myc-Tag Mouse mAb 抗体，室温孵育1 h；加细胞裂解液并充分混匀后，置于4 ℃翻转摇床孵育过夜；2 500 r/min 离心5 min，弃去上清，同样方法用PBS 洗涤5 次；最后加入20 μL PBS 和相应体积的Loading Buffer，制备蛋白样品。以上均设置一个空载体对照组，ORF2 转染设置3 个平行组（A、B和C）。

1.2.4 银染试验和蛋白质谱分析

参照银染试剂盒说明书进行银染试验，注意操作中一定要使用纯水或超纯水，以降低显色背景显色时间约为1～2 min，蛋白条带出现后快速加入终止液，以防过曝；显色后，切胶条，低温保存，送上海中科新生命生物科技有限公司，利用QE 质谱仪进行蛋白质谱分析，MASCOT 等质谱匹配软件分析蛋白数据。

1.2.5 生物信息学分析

基于蛋白质谱分析获得的蛋白数据，利用Venny2.1.0分析对照组与试验组的差异蛋白；将获得的靶蛋白输入STRING 蛋白质相互作用数据库，进一步筛选与ORF2 互作的靶蛋白，筛选条件设置为：最低相互作用得分为高可信度0.7 分，数据来源为试验验证。将获得蛋白序列号上传至STRING 数据库进行检索，使用R（4.2.1）版本获得网络内部的蛋白相互作用关系，综合以上信息并使用Cytoscape 3.5.0软件构建相互作用蛋白网络。

分别使用R软件（4.2.1）版本语言包中的ggplot2[3.3.6]和cluster Profiler，对靶蛋白进行GO分析和KEGG分析，显著性cut-off值一般设置为校正后P＜0.05，对富集分析结果进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 pCAGEN-myc-ORF2 重组质粒的构建及其在Huh-7细胞中的表达鉴定（见图1）

图1 pCAGEN-myc-ORF2重组质粒的构建与表达鉴定Fig.1 Construction and expression identification of pCAGEN-myc-ORF2 recombinant plasmid

由图1（a）可知，利用HEV Kernow C1/P6 质粒为模板cDNA，通过PCR反应成功克隆出ORF2全长基因，与预期条带大小接近（1 983 bp），且无非特异性扩增条带。

由图1（b）、图1（c）可知，连接产物经转化挑菌后，菌液PCR鉴定发现，1、2、4、5均为阳性；提取质粒后的双酶切鉴定发现两个克隆酶切条带大小均合适，将两个阳性菌液测序后，将测序正确的阳性克隆命名为pCAGEN-Myc-ORF2。

由图1（d）可知，该质粒转染进Huh-7细胞后，Western blotting 鉴定发现pCAGEN-Myc-ORF2-1 成功表达，与预期条带大小一致（72 kD）。

2.2 ORF2互作蛋白的筛选（见图2、图3）

图2 免疫共沉淀产物银染分析Fig.2 Silver staining analysis of CO-IP products

图3 韦恩图分析Fig.3 Wayne diagram analysis

由图2可知，与对照组相比，试验组KerORF2-A、B、C等3 条泳道均有多条差异条带，并且3 个试验组条带基本一致。切胶进行蛋白质谱分析后，利用MASCOT 等质谱匹配软件分析蛋白数据，分析获得的不同组别的蛋白数据，将对照组和3个试验组（KerORF2-A、B、C）蛋白的序列号（Acession No.）输入Venny 2.1.0 中，经韦恩分析最终得到37个潜在的互作蛋白（见图3）。

2.3 生物信息学分析（见图4、表1、图5）

图4 ORF2-Huh-7互作蛋白的互作网络图Fig.4 Interaction network diagram of ORF2-Huh-7 interacting proteins

图5 GO和KEGG富集分析Fig.5 GO and KEGG enrichment analysis

通过R（4.2.1）软件筛选互作蛋白并上传STRING数据库得到23 个蛋白的相互作用网络图，发现这些蛋白之间存在复杂的互作关系（见图4），如VDAC1、ENO1、HSP90AA1、RPL7/19/24 等。

由表1可知，23个靶蛋白主要参与了生物过程（BP）有27 个、涉及的细胞组分（CC）有27 种，以及相关分子功能（MF）9个；KEGG分析得到2个途径与疾病/病毒相关。

使用R（4.2.1）版本中的ggplot2 包对GO 富集分析和KEGG 信号通路结果取前3 进行可视化，得到主要参与的BP：RNA 剪接的调控、细胞质翻译、端粒酶活性的调节；CC：胞质核糖体、空泡腔、细胞质大核糖体亚单位；MF：钙黏蛋白结合、泛素-蛋白质连接酶、蛋白质连接酶结合中的泛素；KEGG：核糖体和新型冠状病毒（见图5）。

3 讨论

探究病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用，有助于揭示病毒的感染和致病机制，为提出新的抗病毒策略提供线索[7]。人HEV感染主要通过食用肉制品，HEV可在肝脏和胆汁中蓄积，也可在小肠及大肠内增殖。动物HEV 与人HEV 的分割界限越来越模糊，且猪养殖数量大、养猪业的从业人员多等因素导致猪HEV成为主要的公共卫生问题。目前研究多将猪作为HEV 的重要病毒库，且近年来HEV的关键性作用靶点也是研究热门；而且，HEV 在人群中造成规模流行需要经过进一步的遗传进化及宿主嗜性改变[8]。基于以上原因，本研究选择猪作为研究对象。

由于HEV主要以无囊膜形式传播，含有主要抗原表位的衣壳蛋白直接参与病毒对细胞的吸附和入侵[9]。近年来，为探索与病毒感染相关的宿主蛋白，针对ORF2与宿主蛋白的互作研究取得一定的进展[10]。研究发现，ORF2 可以与多种跨膜蛋白互作，参与HEV的吸附和入侵，如硫酸乙酰肝素蛋白（HSPG）[11]和脱唾液酸糖蛋白受体1/2（ASGR1/2）[12]；此外，ORF2 还与一些分子伴侣相关，如与热休克蛋白90（HSP90）相互作用，参与HEV在细胞间的转运[13]；ORF2过表达时，HSP72、HSP70B和HSP40等因子表达水平上调，猜测有利于HEV感染细胞抵抗凋亡[14]；ORF2也可竞争性地使因子Ikβ 与Cul1 和SKP1 的结合显著减少，调节病毒的复制和增殖[15]。近期有研究发现，细胞周期调控蛋白42（CDC42）和Ras相关蛋白1b（Rap1b）直接结合ORF2，利用感染性克隆验证发现上述两种蛋白均在HEV 的早期感染阶段发挥作用[16]。综上，虽然众多与ORF2 互作的宿主蛋白已被发现，但由于缺乏高效的体外培养体系等原因，已有相关研究大多未能揭示其在HEV感染中的具体作用机制[11]，且决定HEV感染的关键受体蛋白尚未被发现。因此，探索与ORF2 互作的宿主蛋白仍具有一定的科学意义，既能够发现新的参与HEV感染的宿主细胞蛋白，也有望筛选到HEV感染的关键受体。

本研究构建HEV ORF2真核表达质粒，并成功表达于HEV 易感细胞系-Huh-7 细胞中，模拟了病毒感染的细胞内环境下ORF2的表达，利用免疫共沉淀-蛋白质谱技术，初步获得与ORF2互作的37个细胞蛋白，生物信息学分析结果表明，其中23个靶蛋白存在复杂的互作网络关系；这些蛋白多参与众多细胞器的合成，参与RNA剪接的调控、细胞质翻译等生物过程，参与胞质核糖体、空泡腔等细胞器的合成，同时也在如钙黏蛋白结合、泛素-蛋白质连接酶等功能中发挥作用，并且影响核糖体合成途径、参与新型冠状病毒感染等。

Tian 等[10]和Subramani 等[11]分别利用酵母双杂交技术筛选与ORF2 互作蛋白，前者主要针对基因1 型和4 型HEV 毒株，与本研究所筛选到的靶蛋白几乎无重叠，仅有相同蛋白家族的ACTG1。而后者针对基因1 型和3 型HEV 毒株，筛选到的ORF2 互作蛋白仅有两个：PCBP1 和RPL29；RPL29 与本研究中筛选到的RPL7/19/24 属于同类蛋白。本研究筛选获得了23个靶蛋白，为ORF2互作蛋白的数据库填补了空白。其中VDAC1、ENO1和HSP90AA1等蛋白均参与病毒的感染过程[17-19]，VDAC1、BAG2 和PSMB4等蛋白与癌症相关[20-22]，推测可能与本试验选取的宿主细胞Huh-7是肝癌细胞相关。本研究HEV 基因型的靶向蛋白提供了依据，为后续攻克病毒至关药物靶点提供科学解释。

4 结论

本研究使HEV ORF2 的重组质粒成功表达于Huh-7细胞中，经免疫共沉淀分析、银染和蛋白质谱分析获得37 个靶蛋白，生物信息学分析其涉及的细胞成分、通路途径和疾病与病毒的关系，为后续深入研究其他HEV基因型以及动物与宿主间的细胞蛋白与ORF2 的互作及其在HEV感染中的分子机制及兽用药物靶点提供了一定参考。