罗非鱼无乳链球菌gap 基因的原核表达及免疫原性研究

杨 洋，农 源，陈 林，孙彤彤，黄远城，李恭贺，2，3，4，郑喜邦，2，3，4，吴文德，2，3，4*

（ 1. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530004 ； 2. 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心，广西 南宁 530004 ； 3. 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室，广西 南宁 530004 ； 4. 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室，广西 南宁 530004 ）

罗非鱼（Oreochromis niloticus）具有耐受性强、饲料转化率高等优点，具有极高的市场需求[1]。无乳链球菌可引起罗非鱼大量死亡，造成巨大的经济损失[2-3]。因此，有必要制定适用于罗非鱼养殖的预防或疾病治疗措施。目前控制罗非鱼链球菌病的主要方法是使用抗生素，但易产生耐药菌株及药物残留，不符合绿色防控的原则[4-7]。免疫接种从提高鱼体免疫力出发，因其高效特异、环境友好被认为是水产病害防控最具有潜力的手段之一。细菌表面蛋白完全暴露于宿主免疫系统，并能够诱导高水平的免疫反应。gap基因的产物三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）广泛存在于生物界，通常位于细菌细胞表面，可在感染过程中与宿主基质蛋白结合。有报道在感染小鼠的无乳链球菌中检出GAPDH，并认为其是一种毒力相关的免疫调节蛋白[8]。GAPDH已被确定为许多病原体的候选疫苗，有研究发现[9]，母体免疫rGAPDH 可保护新生小鼠免于无乳链球菌感染引起的死亡，表明无乳链球菌GAPDH 可作为一种合适的靶抗原制备抗无乳链球菌感染的有效疫苗。也有研究表明，来自格氏乳球菌的GAPDH 蛋白对罗非鱼乳球菌病具有有效的保护作用[10]。本研究对罗非鱼无乳链球菌gap基因进行扩增，通过原核表达系统表达并纯化重组蛋白，动物试验分析其免疫原性和保护效果，为进一步利用该蛋白防控罗非鱼无乳链球菌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

试验罗非鱼200 尾购自广西某水产养殖有限公司，体重为（50±2） g，体长（13.0±0.5） cm。试验前暂养10 d，水温（30.0±0.5） ℃，气泵24 h 供氧，饲料每日投喂体质量的2%。本试验于广西大学水产基地进行。

1.1.2 试剂与仪器

Premix Taq™、pMD™18-T 载体克隆试剂盒、限制性内切酶BamH Ⅰ/Sal Ⅰ、T4 DNA Ligase 购自Takara 公司；DH5α和BL21感受态细胞、抗His标签鼠单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠IgG（H+L）抗体购自北京全式金生物技术有限公司；IPTG 粉末、透析袋、弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma 公司；pET-28a-SUMO 表达载体、HRP 标记的抗罗非鱼IgM单克隆抗体、无乳链球菌HN016株由广西大学动物科学技术学院兽医临床实验室保存。

PCR 仪、水平电泳仪（赛默飞公司）；细胞超声波破碎仪（南京先欧仪器制造有限公司）；垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；凝胶分析系统（上海天能生命科学有限公司）；低温高速离心机（Sigma 公司）；化学发光成像仪（Cytiva公司）；酶标仪（Bio-Rad公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 重组载体pET-28a-gap的构建

无乳链球菌提取全基因组DNA，根据GenBank登录号WP_006738473.1 设计引物：gap_F：5'-GGATCCatggtagttaaagttggt-3'，gap_R：5'-cGTCGACttattttgcaatttttgc-3'。

PCR扩增反应体系：上下游引物各10 nmol/L、DNA模板50 ng、Premix Taq 25 μL，加ddH2O 至50 μL。反应程序：95 ℃变性30 s，48 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共30 个循环。对PCR 产物进行电泳并回收。gap 片段与表达载体pET-28a-Sumo 进行BamH Ⅰ、Sal Ⅰ分别双酶切并用T4 连接酶连接。连接产物转化E.coliDH5α 克隆菌株，提取质粒，进行双酶切和测序鉴定，测序正确的质粒命名pET-28a-gap。

1.2.2 重组载体诱导表达条件的优化

构建成功的质粒pET-28a-gap 转化E.coliBL21（DE3）表达菌株，挑取单克隆到含Kan 抗性的TB 培养基中，培养至OD600nm值为0.6～0.8时，加入终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0、3.0 mmol/L 的IPTG，在16、23、30、37 ℃的不同温度下，220 r/min诱导4、8、12、16 h后，同时设立转化pET-28a-SUMO空质粒的BL21（DE3）菌株和未加诱导剂的pET-28a-gap 重组质粒的BL21（DE3）菌株分别作为空白和阴性对照。离心收集菌体并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测目的蛋白的表达情况，确立最优表达条件。取适量最优表达条件下的菌体，超声破碎后分离上清与沉淀，SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。

1.2.3 重组蛋白的Western blot鉴定

设立空质粒pET-28a-SUMO 作为空白对照，与诱导表达的菌液变性并经SDS-PAGE电泳后，通过湿转法转至PVDF膜后用5%脱脂奶粉封闭，以抗His标签鼠单克隆抗体为一抗，HRP标记山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体为二抗，按照抗体说明书稀释后进行孵育，孵育结束后清洗PVDF膜，采用ECL化学发光法显影并采集图像。

1.2.4 重组蛋白的纯化

按照1.2.2构建的条件大量培养重组载体转化菌，收集菌体沉淀并清洗后，冰上超声波破碎菌液，低温离心收集上清，0.45 μm滤器过滤，Ni琼脂糖凝胶柱进行亲和层析纯化。对收集的洗脱液进行SDS-PAGE分析，纯化后的蛋白用7000D透析袋除去杂盐和浓缩，并检测其蛋白浓度。

1.2.5 重组蛋白疫苗的制备及免疫原性检测

健康罗非鱼随机分为攻毒组、免疫组、空白组，每组50 尾。用无菌PBS 对纯化的gap 蛋白进行稀释并与弗氏佐剂进行1∶1 混合乳化，按照2 μg 蛋白/1 g 鱼体重的剂量对免疫组进行腹腔注射，攻毒组和空白组注射同体积的PBS 与佐剂混合物。试验鱼共接受3 次免疫，两次注射间隔8 d，首免使用弗氏完全佐剂，后续两次加强免使用弗氏不完全佐剂。3 次免疫前和攻毒前后每组随机抽取10 尾鱼尾静脉采血0.5 mL，血样4 ℃过夜后分离血清，采用间接ELISA方法测定血清免疫球蛋白M（IgM）抗体水平。

1.2.6 重组蛋白疫苗的免疫保护作用

免疫结束后用无乳链球菌对罗非鱼进行攻毒试验。菌体浓度1×108CFU/mL。攻毒组和免疫组每尾鱼腹腔注射0.1 mL 无乳链球菌，空白组注射同体积的生理盐水，按照公式计算各组相对免疫保护率（RPS）。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行单因素方差分析，GraphPad Prism 9.0软件制图。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 载体pET-28a-gap的构建及鉴定（见图1）

图1 载体pET-28a-gap的构建及鉴定Fig.1 Construction and identification of carrier pET-28a-gap

由图1（a）可知，PCR结果为单一且清晰的1 011 bp的片段，与预期结果一致，表明成功扩增gap基因。

由图1（b）可知，构建的载体经双酶切鉴定，获得5 614和1 011 bp 的两个片段，质粒DNA 测序与预期序列相同，表明重组载体pET-28a-gap成功构建。

2.2 重组蛋白gap高效表达体系的建立（见图2～图4）

图2 诱导剂浓度的表达条件优化Fig.2 Optimization of expression conditions of inducer concentration

重组表达载体目的蛋白的分子量理论值为49.8 ku，转化重组载体pET-28a-gap 的E.coliBL21（DE3）菌株在各条件下均能够在预期位置成功表达重组蛋白。

由图2 可知，低浓度下蛋白表达量与诱导剂浓度呈正相关，但0.4 mmol/L以上时浓度蛋白含量不再随着诱导剂浓度的增大而呈明显变化，选择IPTG 0.4 mmol/L为gap蛋白的最优诱导剂浓度。

由图3 可知，gap 蛋白的表达量随着诱导温度增高而增加，但诱导温度超过23 ℃后表达量不再出现明显增加，低温能够保持蛋白质的活性，选择23 ℃为gap蛋白的最优诱导温度。

由图4 可知，gap 蛋白的表达量随着诱导时长增加而增加，诱导时间超过12 h后表达量下降，选择12 h为gap蛋白的最优诱导时长。

2.3 重组gap 蛋白的表达形式分析与Western blot 检测（见图5）

图5 重组gap蛋白的表达形式分析与Western blot检测Fig.5 Analysis of expression forms and western blot analysis of recombinant protein gap

由图5（a）可知，在0.4 mmol/L IPTG、23 ℃条件下诱导12 h，gap蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达在上清中，沉淀中几乎未见表达的gap蛋白。由图5（b）可知，在预期位置49.8 ku处出现清晰的反应条带，空质粒未出现明显的免疫印迹，表明重组质粒pET-28a-gap成功表达了gap蛋白。

2.4 重组gap蛋白的SDS-PAGE分析（见图6）

图6 重组gap蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified protein gap

由图6可知，不同阶段的洗脱液通过SDS-PAGE分析进行比较，纯化后各管洗脱液均出现大小为49.8 ku的高浓度单一条带，且与纯化前的目的条带位置相同；流穿液的初段含大量杂蛋白条带与目的条带，末段不再含有条带，表明已洗脱充分。经检测蛋白浓度约为2.62 g/L。

2.5 重组蛋白疫苗免疫对罗非鱼血清抗体效价的影响（见图7）

图7 重组蛋白疫苗免疫对罗非鱼血清抗体效价的影响Fig.7 Detection of ELISA antibody level of tilapia at different time periods

由图7 可知，免疫前各组罗非鱼血清抗体效价差异不显著（P＞0.05）；免疫8 d后，免疫组罗非鱼血清抗体效价显著高于未免疫组（P＜0.05）；免疫组罗非鱼接受一次免疫注射后血清抗体效价与接受两次注射差异不显著（P＞0.05），接受3 次免疫注射后的血清抗体效价显著高于前两次（P＜0.05）；攻毒结束后，免疫组罗非鱼血清抗体效价显著高于攻毒组和空白组（P＜0.05），免疫组和攻毒组罗非鱼血清抗体效价均显著高于空白组（P＜0.05）。

2.6 重组蛋白疫苗免疫对罗非鱼的保护效果（见图8）

图8 重组蛋白疫苗免疫对罗非鱼的保护效果Fig.8 Protective effect of recombinant protein vaccine on tilapia

罗非鱼攻毒后1 d 免疫组和攻毒组均开始出现死亡，攻毒后4 d 达到死亡高峰，7 d 后不再发生死亡。攻毒后，病鱼体色发黑，停止进食，鱼体失衡，在水面转圈，最后沉底死亡，为典型无乳链球菌感染症状；剖检腹腔有腹水，脏器组织分离并划线血平板均可见无乳链球菌生长。由图8可知，无乳链球菌腹腔注射罗非鱼后，免疫组、攻毒组、空白组的死亡率分别为28%、78%、0，相对保护率为64.1%。

3 讨论

无乳链球菌是引起罗非鱼链球菌病的主要病原体[11]，能否有效控制该病已成为水产养殖研究的重点。为符合食品安全和粮食安全政策，抗生素等逐渐被禁用，因此通过疫苗接种激活鱼类的自我免疫力是控制链球菌病最实用、最可靠的方法。目前，鱼用无乳链球菌疫苗趋于多元化发展，包括灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗等。然而，灭活疫苗的功效性和减毒活苗的安全性有待考证[12]。近年来，重组蛋白疫苗研究领域受到了越来越多的关注，有以下3方面原因：首先，灭活疫苗等可能出现“毒力返祖”现象，造成抗原损害，重组蛋白疫苗很少出现安全性问题；其次，重组蛋白疫苗选择高度保守区域进行表达，可用作对抗多种血清型病原体的通用疫苗；最后，该疫苗可以区分动物是否被接种，可作为标记疫苗。膜蛋白最先被宿主的免疫系统识别，激发宿主机体产生相应的免疫机制。近年来，相关免疫蛋白的报道屡见不鲜，大多均可列为亚单位疫苗的候选蛋白[13-14]。gap基因的产物蛋白是糖酵解途径中的一种关键代谢酶，具有多种生物学活性，同样能够帮助病原菌对宿主的黏附和侵染[15]，其生物学功能在鱼类病原体如气单胞菌、弧菌、爱德华氏菌、海豚链球菌以及副乳链球菌和停乳链球菌中均有报道，但关于对鱼源无乳链球菌gap蛋白的分析尚未见报道。

本研究扩增出gap基因的序列经过Blast 比对与野毒株重合度100%，高度保守，表明选择此膜基因作为蛋白疫苗，预期免疫效果相对稳定。包涵体形式表达的蛋白，需要专用溶解液将蛋白先变性再复性[16]，过程中存在大量损耗；该蛋白主要以可溶性形式表达，纯化简便，产量高。蛋白足量表达纯化后制成重组蛋白疫苗免疫罗非鱼，并对其免疫保护作用进行评估。古丽米热·对山巴依等[17]用马腺疫链球菌GAPDH 蛋白免疫小鼠，结果也在小鼠血清中检测到较高水平的特异性抗体IgG。本研究数据分析显示，间接ELISA可检测到相应的抗体，且随着免疫接种次数和剂量的增加，血清抗体水平呈现上升趋势，与曾祖聪等[18]得出的结论一致。对于无乳链球菌感染后存活的罗非鱼，攻毒组血清中抗体水平显著升高，免疫组前后无显著变化，猜测血清抗体水平不能代表罗非鱼对无乳链球菌抗感染的能力。攻毒罗非鱼观察试验结果发现，发病初期，免疫组和攻毒组死亡情况相当，4 d后攻毒组持续死亡，免疫组死亡情况趋于平缓，直至不再死亡，表明对于外来致病菌的攻击需要一定的时间启动体液免疫[19]。

4 结论

本研究利用PCR 对罗非鱼无乳链球菌gap基因进行扩增，构建原核表达载体pET-28a-gap，优化表达条件，获得高纯度重组gap 蛋白，通过腹腔注射罗非鱼验证其免疫原性。结果显示，gap基因表达的重组蛋白能够显著诱导罗非鱼体内的免疫应答，可作为防控罗非鱼无乳链球菌感染的候选亚单位疫苗。