乙醇-硫酸铵双水相体系萃取虾青素的研究

王世云,冯金华,黄思玉,徐秋彤

(河北农业大学,河北,秦皇岛 066003)

虾青素是一种天然的类胡萝卜素。虾青素具有强烈的抗氧化性,能被氧化剂氧化为虾青素醌和其它衍生物,在市场上的应用范围广阔。虾青素在水产养殖、药用、食用等方面主要应用虾青素的抗氧化和增强免疫力的能力。另外,在日本也已推出含有虾青素成分的眼保护剂[1]。由Mara公司研发的红球藻虾青素产品(AstaFactor),比其他26种著名的抗炎产品具有更显著的抗炎抗感染作用[2]。虾青素已被研究用于包括对眼睛、心脏和大脑健康的临床应用[3]。

虾青素来源有两大类:化学合成和天然虾青素。合成虾青素具有与天然虾青素相同的分子结构,为含有不同立体异构体的混合物[4]。动物体对化学合成的虾青素吸收能力较弱,与天然虾青素相比其着色能力和生物效价低得多,美国食品与药物管理局(FDA)已经禁止化学合成的虾青素进入食品和膳食补充剂市场[5],这种来源虾青素随着天然来源虾青素产业的兴起终将被淘汰。天然虾青素来源广泛,可从红发夫酵母、粘红酵母、雨生红球藻、铜绿小球藻以及虾、蟹壳等多种生物中提取。雨生红球藻中虾青素含量可高达细胞干重的4%,被公认为生产天然虾青素的最佳来源。目前有多种雨生红球藻虾青素提取物在售卖,有效成分虾青素含量在1%～10%左右。

双水相体系萃取虾壳中虾青素已有报道[6]。乙醇-硫酸铵双水相能够使虾壳虾青素乙醇提取液中80%以上虾青素包括游离虾青素及虾青素酯形成沉淀,而集中于双水相的上下两相之间。该法具有分相快速、处理量大、环境友好、不用加热等优点,有利于虾青素的浓缩和虾青素固体的制备,在工业生产虾青素中具有一定的应用潜力。但是将乙醇-硫酸铵双水相系统用于从雨生红球藻虾青素提取物中纯化虾青素还未有报道。本试验采用乙醇-硫酸铵双水相体系从含虾青素5%的雨生红球藻虾青素粉中提取虾青素,可以为双水相体系在虾青素制备中的更广泛应用提供一些试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料 5%雨生红球藻虾青素粉,购买于济南鲁源生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器 721型可见分光光度计,上海舜宇恒平科技有限公司生产;FA2104N型精密分析电子天平,上海菁海仪器有限公司生产;IC-20A型岛津高效液相色谱仪,Shimadzu岛津公司生产;DKE-3双功能水浴恒温振荡器,金坛市杰瑞尔电器有限公司生产;80-2离心机,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司生产;UV-1800PC全波长扫描型紫外可见分光光度计,济南欧威腾生物科技股份有限公司生产。

1.1.3 主要试剂及耗材 虾青素标准品(S13036-250 mg,≥98.0%),由上海源叶生物科技有限公司生产;硅胶板(规格50×100 mm;厚度0.20～0.25 mm),由青岛海洋化工有限公司生产;无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷,丙酮,分析纯,由天津市鑫铂特化工有限公司生产;硫酸铵,分析纯,由天津市科密欧化学试剂有限公司生产;甲醇,色谱纯,由天津欧博凯化工有限公司生产;四氢呋喃,色谱纯,由天津赛孚瑞科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 雨生红球藻虾青素粉中虾青素的提取 制备两种浓度的虾青素提取液。分别取0.4 g和0.5 g雨生红球藻虾青素粉加入10 mL无水乙醇,室温避光提取30 min,然后4 000 r/min离心10 min,取上清液,沉淀重复此操作3次,分别合并4次上清液,作为浓度为C1和C2的雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液。

1.2.2 双水相萃取虾青素

采用双水相萃取虾壳中虾青素探索的乙醇-硫酸铵双水相体系[6]。共包括8个体系,分别为:

无水乙醇∶20% (NH4)2SO4(v/v)=1∶1、1∶1.25、1∶1.5;无水乙醇∶30%(NH4)2SO4(v/v)=1∶1.5、1∶1.75、1∶2、1∶2.25、1∶2.5,其中(NH4)2SO4溶液为质量体积分数。

在进行虾青素萃取试验时,将上述成相体系中的无水乙醇换成1.2.1中制备的雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液。取3 mL虾青素提取液,按比例加入相应体积的20%或30%硫酸铵溶液,混匀,避光静置1 h,至体系分相完全。

分别记录各分相体系上下相体积。将上相取出后,避光-15 ℃保存,待检测。中间相用移液枪抽取出来后,加水,8 000 r/min离心10 min,取沉淀,乙酸乙酯溶解,避光-15 ℃保存,待检测。

1.2.3 虾青素的高效液相色谱检测

高效液相色谱检测条件为:C18(250 mm×4.6 mm)色谱柱,室温,进样量10 μL,检测波长为476 nm,采用甲醇(B)和四氢呋喃(A)梯度洗脱,流速0.8 mL/min。

在检测雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液中是否含有虾青素酯时,采用冯金华等[6]的梯度洗脱条件。

在确定原料中不含虾青素酯后,后续检测的洗脱条件见表1。

表1 高效液相色谱流动相洗脱条件

在检测上相虾青素含量时,为去除硫酸铵对样品检测的影响,取100 μL各样品溶液加2 mL水,然后再加入1 mL乙酸乙酯,将虾青素及其他色素萃取入乙酸乙酯相,取乙酸乙酯相进行高效液相测定。

1.2.4 虾青素的薄层色谱测定 薄层板为50×100 mm的硅胶板,展开剂:25%丙酮和75%正已烷。

1.2.5 虾青素的紫外可见光谱检测 检测样品在300～800 nm的吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 雨生红球藻虾青素粉中虾青素的鉴定

2.1.1 紫外-可见光谱 如图1所示,虾青素标准品乙酸乙酯溶液的紫外-可见吸收光谱只有一个吸收峰,在476 nm。雨生红球藻虾青素粉提取液的紫外-可见吸收光谱有两个主要吸收峰,分别在490 nm和440 nm附近,与虾青素的最大吸收峰在476 nm相比相差很大,说明在雨生红球藻虾青素粉中含有比较多的不同于虾青素的杂色素。

1:虾青素标准品

2.1.2 高效液相色谱

以虾青素的最大吸收波长476 nm为检测波长,进行雨生红球藻虾青素粉乙酸乙酯提取液的HPLC检测。如图2所示,游离虾青素的吸收峰在5.3 min左右。

图2 虾青素标准品的HPLC图

雨生红球藻中虾青素含有70%的单酯和25%的双酯形式的虾青素,只有不到5%的游离虾青素[7]。在前期检测虾壳中虾青素时[6],游离虾青素出峰时间5.3 min左右,虾青素单酯和虾青素双酯出现在14.0～45.0 min之间。当采用相同的检测方式检测雨生红球藻虾青素提取液中虾青素的类型时,如图3所示,所有吸收峰都出现在10 min之前,在14.0～45.0 min之间没有出现吸收峰,所以雨生红球藻虾青素粉中基本不含虾青素单酯和虾青素双酯,5.3 min左右出现了游离虾青素的吸收峰,但除此之外,在2～5 min之间出现了多个杂色素的吸收峰,在6.5～7.0 min之间出现了小的杂色素吸收峰。图3告诉我们,雨生红球藻虾青素粉中含有游离虾青素,不含有虾青素酯,游离虾青素的含量不是很高,含有多种杂色素,杂色素的含量比较高。

2.1.3 薄层色谱 由图4可知,雨生红球藻虾青素粉中虾青素主要为游离虾青素,除此之外,在游离虾青素下方出现比较长的紫红色的杂色素带。也说明雨生红球藻虾青素粉中只含有游离虾青素,不含有虾青素酯,含有比较多的紫红色的杂色素。

2.2 雨生红球藻虾青素粉中虾青素的双水相分离

2.2.1 双水相的分相情况

经试验,雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶20% (NH4)2SO4(v/v)=1∶1、1∶1.25、1∶1.5及雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶30%(NH4)2SO4(v/v)=1∶1.5、1∶1.75、1∶2、1∶2.25、1∶2.5组成的8个体系都能快速分相。而且,分相完全后,8个体系的上相都为紫红色,下相无色澄清,上下相交界面上有固体颗粒存在。

同文献[6]所述相同,8个体系都有沉淀聚集在上下相之间,但上相是非常明显的紫红色,说明8个体系都不能将提取液中所有色素都沉淀下来,只有少量色素沉淀。为确定中间沉淀出来的色素是虾青素,还是虾青素与杂色素的混合物,还是杂色素,需要进一步检测。在进一步的检测时,因为色素主要存在于上相和中间相,因此主要就这两相进行检测。

2.2.2 高效液相色谱虾青素标准曲线 如图5所示,游离虾青素标准曲线为:y=36 308x-5 794.6,R2=0.999 4。

2.2.3 虾青素沉淀率

制备的两个浓度的雨生红球藻虾青素提取液中虾青素浓度分别为:C1=14.09 μg/mL;C2=18.24 μg/mL。

雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液与20%硫酸铵形成的分相体系主要有3个。如表2所示,随着硫酸铵体积的增加,上相体积逐渐增加。在两个检测浓度下,3个双水相体系上相中的虾青素与萃取前相比,都减少,说明提取液中的虾青素在中间相有一定的沉淀。从沉淀率看,随着20%硫酸铵体积的增加,虾青素在中间相的沉淀率逐渐增大。2个浓度的虾青素提取液,表现出相同的趋势,都是虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5时沉淀率最高,都大于70%。

表2 20%硫酸铵和虾青素提取液的双水相体系对虾青素的沉淀效果

雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液与30%硫酸铵形成的分相体系主要有5个。如表3所示,5个体系在两个检测浓度下,上相中残留的虾青素与萃取前相比,总量都减少,说明提取液中的虾青素在中间相都有一定的沉淀。如表3所示,随着硫酸铵体积的增加,上相体积逐渐减少,虾青素在中间相的沉淀率基本呈现逐渐增大的趋势。两个个浓度的虾青素提取液,表现出相同的趋势,且都是虾青素粉乙醇提取液∶30%硫酸铵(v/v)=1∶2.5时,虾青素在中间相的沉淀率最高,沉淀率大于70%。

表3 30%硫酸铵和虾青素提取液的双水相体系对虾青素的沉淀效果

虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5和虾青素粉乙醇提取液∶30%硫酸铵(v/v)=1∶2.5两个双水相体系相比,虾青素在中间相的沉淀率比较接近,都大于70%。本着降低成本的角度,采用虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系从雨生红球藻虾青素粉中沉淀虾青素更有利。

2.2.4 双水相沉淀虾青素样品的纯度检测 对采用虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系制备的中间相沉淀进行检测。

2.2.4.1 高效液相色谱检测

如图2所示,游离虾青素在5.0～5.5 min之间出峰。如图6所示,雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液中除游离虾青素外,在5.0 min之前出现多种杂色素吸收峰,为提取液中主要杂色素,6.5～7.0 min之间也出现少量色素。

图6 雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液

如图7所示,雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系中间相主要含两种成分,出现在5.0～5.5 min之间的游离虾青素为主要成分,另一种为6.5～7.0 min的物质。原提取液中在5.0 min之前出现的杂色素在中间相中基本没有。说明中间相中沉淀出的主要为虾青素。

图7 雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系中间相

如图8所示,雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系的上相,主要为出峰时间为5.0 min之前的杂色素,游离虾青素的含量很少。

由以上可知,采用雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系可以使虾青素很好地在中间相沉淀,不仅沉淀率可达70%以上,而且纯度相对较高,可把提取液中的主要杂色素留在上相。

2.2.4.2 薄层色谱检测如图9所示,1∶1.5(20%硫酸铵)双水相萃取体系中间相(2)中色素基本都为游离虾青素,基本没发现杂色素带;而上相(4)主要为杂色素带,基本没有游离虾青素的色带。

注:1:标准品;2:中间相;3:雨生红球藻虾青素粉提取液;4:上相

2.2.4.3 紫外-可见光谱检测

如图10所示,雨生红球藻虾青素粉的提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5双水相萃取体系中间相与虾青素标准品的吸收光谱很相似,只有一个大的吸收峰,在473 nm,虾青素标准品的吸收峰在476 nm,二者很相近,说明中间相虾青素纯度比较高。上相的吸收峰主要有两个,在431 nm和531 nm,与虾青素标准品的吸收峰相差比较大,基本可以看成是杂色素的吸收峰。

图10 紫外-可见吸收光谱

从高效液相色谱、薄层色谱、紫外-可见光谱分析都可以看出:雨生红球藻虾青素粉的提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5体系中间相沉淀为纯度比较高的虾青素,杂色素则被分配于上相。

3 讨论

随着天然虾青素越来越受到大众的欢迎,天然虾青素的提取纯化工艺成为研究的热点。天然虾青素的分离纯化方法有很多,如:超临界流体萃取、柱色谱法等[8-9],但存在着成本高或操作复杂等问题。

双水相萃取法具有分相速度快、低温、耗能小、适合大规模操作等优点。但双水相用于色素分离,主要是利用色素在双水相上下两相的分配不同,从而将色素萃取到上相或下相来进行分离的[10-11]。在前期研究中发现,采用乙醇/硫酸铵双水相体系萃取虾壳中虾青素,可使虾青素以固相的形式沉淀在两相之间,采用虾青素乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.25的体系可以使88.0%以上的虾壳虾青素沉淀下来[6]。

本研究原料是5%雨生红球藻虾青素粉,是皂化后的虾青素粉。研究发现,乙醇-硫酸铵双水相体系可以使虾青素粉提取液中的游离虾青素沉淀下来。采用雨生红球藻虾青素粉乙醇提取液∶20%硫酸铵(v/v)=1∶1.5的体系可以使70%以上的游离虾青素沉淀下来而聚集在上下两相之间,而绝大多数的杂色素分配在上相。所以可以采用乙醇-硫酸铵双水相体系从雨生红球藻虾青素粉中制备虾青素沉淀,不仅提取率高,而且纯度比较高。该研究进一步表明乙醇-硫酸铵双水相体系在虾青素纯化方面具有潜力。