凹凸棒石对锦鲤非特异性免疫及抗氧化指标的影响

侯树旺,杨圆圆,方珍珍,孙学亮,陈成勋

(天津农学院水产学院,天津 300384)

锦鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)近年来深受广大消费者们的喜爱,被称为“水中活宝石”“会游泳的艺术品”[1],现在人们对观赏鱼健康以及观赏性的要求越来越高,但随着大面积集约化养殖的发展以及抗生素滥用等原因,导致了锦鲤自身免疫能力较差的缺陷,因此通过改善饲料来提高锦鲤的免疫能力显得尤为重要[2]。凹凸棒石(Attapulgite,APT)又名坡缕石,具有“万用之土”的美誉[3],目前我国甘肃等地已探明的凹凸棒石储量达11亿吨,占世界总储量的4/5[4]。凹凸棒石具有诸多优异的生物学功能,且无毒无污染,应用前景十分广阔[5]。研究证明,凹凸棒石在饲料工业中可作为营养增强剂,同时其优异的吸附性还可以吸附动物肠道内的致病菌等有害物质,对动物疾病的防治具有关键作用[6-7]。刘洋等[8]用4 000 mg/kg载锌凹凸棒石替代饲粮中的抗生素,可显著增强断奶仔猪的抗氧化能力和免疫功能;张瑞强等[9]研究证明,在饲料中添加载锌凹凸棒石可以提高团头鲂的抗氧化状态和免疫能力,同时还能缓解运输应激造成的肝脏损伤;王雨雨等[10]报道,在樱桃谷肉鸭的日常饲料中添加少量的凹凸棒石,能够增强鸭胸部和腿部肌肉的SOD活性;同时有研究发现,在饲粮中添加适量凹凸棒石也能明显增加肉鸡空肠及回肠的SOD活性,减少MDA含量[11-12]。但目前凹凸棒石在饲料中的应用主要集中在畜牧方面,在水产饲料上的应用还鲜见报道。因此,本文针对凹凸棒石对锦鲤抗氧化能力及非特异性免疫指标的影响等方面做了简要探讨,旨在为凹凸棒石在锦鲤饲料上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼与养殖管理

本试验以锦鲤为研究对象,平均体重为(115.48±3.72)g、平均体长为(12.90±0.54)cm。选用规格一致、健康活泼的锦鲤240尾,随机分成4个试验组(其中3组为试验组,1组为对照组),每组3个重复,每个重复20尾鱼,于规格为110 cm×45 cm×50 cm的水族箱中养殖。试验鱼消毒后暂养一周,然后随机进行分组,基础饲料驯化1周后,开始正式试验,养殖周期为4周。饲料投喂时间为每日8:00与16:00,饲料投喂方法为饱食法。

1.2 试验饲料

基础饲料组成及营养水平见表1,试验用凹凸棒石购自天津神力特生物科技有限公司。在基础饲料的基础上添加不同浓度的凹凸棒石(0%、3%、5%、8%)制成试验饲料,分别记为0%(A1组)、3%(A2组)、5%(A3组)、8%(A 4组)。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) %

1.3 样本采集及指标测定

1.3.1 样本采集 养殖试验结束后停食24 h,取样,每组取15尾试验鱼,血样采集方法为尾部采血,解剖后取肝脏、脾脏等组织,血液在冰浴条件下用离心机4 000 r/min离心15 min.,取其上清液,所取样本于冰箱-80 ℃中冷冻保存。

1.3.2 指标测定 测定总蛋白(TP,考马斯亮蓝法)、超氧化物歧化酶(SOD,羟胺法)、过氧化氢酶(CAT,钼酸铵法)、酸性磷酸酶(ACP,比色法)、碱性磷酸酶(AKP,比色法)、谷丙转氨酶(GPT,比色法)、谷草转氨酶(GOT,比色法)的活性,以及总抗氧化能力(T-AOC,比色法)及丙二醛(MDA,TBA法)的含量。血清室温融化后直接进行指标测定,指标测定严格按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。

1.4 数据统计分析

试验数据用Excel 2010及SPSS 16.0进行分析处理,对所有数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),当处理数据间差异显著(P<0.05)时,进行 Duncan多重比较,试验结果以平均值和标准差表示。

2 结果

2.1 不同凹凸棒石水平对锦鲤抗氧化指标的影响

由表2可以得知,锦鲤血清中SOD活性在A3组达到最高,且显著高于其他试验组(P<0.05)。锦鲤肝脏中SOD活性在A2组达到最高,且显著高于A4组(P<0.05),但与对照组差异不显著(P>0.05)。锦鲤血清中CAT活性在A2组达到最高,且显著高于其他试验组(P<0.05)。锦鲤肝脏中CAT活性在A3组达到最高,且显著高于A1、A4组(P<0.05),与A2组差异不显著(P>0.05)。锦鲤血清中MDA含量在A3组达到最低,在与对照组的比较中,A2组与A3组的MDA含量均出现了显著性降低(P<0.05),但A4组的MDA含量未出现显著变化(P>0.05)。锦鲤肝脏中A2组、A3组与A4组的MDA含量均显著低于对照组(P<0.05),在A3组达到最佳。锦鲤血清中T-AOC在A2组达到最佳,且显著高于其他试验组(P<0.05)。锦鲤肝脏中T-AOC在A3组达到最佳,且各试验组T-AOC均显著高于对照组(P<0.05)。

表2 不同凹凸棒石水平对锦鲤抗氧化指标的影响

2.2 不同凹凸棒石水平对锦鲤非特异性免疫指标的影响

由表3可以得知,锦鲤血清中ACP活性在A2组达到最高,显著高于其他试验组(P<0.05)。锦鲤肝脏中ACP活性在A3组达到最高,且显著高于A1、A4组(P<0.05),与A2组差异不显著(P>0.05)。锦鲤血清中的AKP活性在A3组达到最高,且各试验组AKP活性均显著高于对照组(P<0.05),在各试验组之间的对比中,A3与A2组差异不显著(P>0.05)。锦鲤肝脏中的AKP活性在A3组达到最高,且与A2组差异不显著,但显著高于A1、A4组。在试验组与对照组的比对中,血清中不同水平凹凸棒石试验组GPT的活性均出现了显著性下降(P<0.05),各试验组之间,血清中的GPT活性均未出现显著变化(P>0.05)。肝脏中A3组和A4组的GPT活性显著低于A1组(P<0.05);在各试验组之间的对比中,肝脏中A2组与A1组之间GPT活力无显著差异(P>0.05)。在试验组与对照组的比对中,锦鲤血清中各凹凸棒石试验组GOT的活性均显著低于A1组(P<0.05);各试验组之间,血清中GOT活性没有出现显著性差异(P>0.05)。锦鲤肝脏中各试验组的GOT活性显均著低于A1组(P<0.05);各试验组之间肝脏GOT活性在A3试验组达到最低;还可以看出,随着凹凸棒石水平的不断提升,血清和肝脏中GOT的活力也在不断下降,但当达到凹凸棒石作用的峰值时,开始出现缓慢上升。

表3 不同凹凸棒石水平对锦鲤非特异性免疫指标的影响

3 讨论

3.1 不同凹凸棒石水平对锦鲤抗氧化指标的影响

在植物和动物的生物体中,存在着SOD、CAT、MDA、T-AOC等抗氧化酶系统,它们都是评价生物体抗氧化能力的重要指标。抗氧化酶系统如SOD、CAT等,在增强吞噬细胞防御等方面发挥着重要作用[13-14]。其中,SOD和CAT作为生物体内十分重要的抗氧化酶,可以通过酶促反应清除自由基,使活性基团的生成与清除处于动态平衡,在生物体的自我保护系统中发挥着十分重要的作用[15]。而MDA是脂质过氧化的主要产物,其在生物体内含量的高低反映了氧化损伤的程度[16]。祝溢锴[17]研究发现,凹土可以通过吸附仔猪消化道大肠杆菌等来缓解病原菌对机体抗氧化功能造成的损伤。本试验结果表明,在锦鲤饲料中添加凹凸棒石显著提高了锦鲤的抗氧化能力,但随着凹凸棒石含量的增加,各抗氧化指标均在活力达到峰值后开始下降。诸学肸[18]通过研究发现,在快大型黄羽肉鸡后期饲粮中添加凹凸棒石负载植物精油复合物,对血清中抗氧化指标无显著影响,这与本试验结果不同,推测可能与养殖品种不同有关。Chen等[19]研究证明, 在日常饲料中添加10 g·kg-1的凹凸棒石可以提高肉鸡空肠和回肠的SOD活性;简谊龙等[20]研究证明,在饲粮中添加改性凹凸棒石,可以显著提高开产前海兰褐蛋鸡血清和肝脏中的SOD活性,同时降低血清中MDA的含量;罗友文等[21]在犬的饲粮中添加了适量的载锌凹凸棒石,试验结果表明,载锌凹凸棒石可以显著提高犬血清中T-AOC和SOD的活性,同时降低了血清中MDA的含量;王世祺等[22]通过研究发现,在肉鸡饲粮中添加适量晶精束解离凹凸棒石,可以显著降低肉鸡胸肌中MDA含量;Zhou等[23]使用凹凸棒石含量为1%的饲料饲喂肉鸡,结果显示肉鸡空肠黏膜CAT的活性显著增加,同时MDA含量也有明显降低;熊小伟[24]研究发现,在肉鸡饲粮中添加不同水平的凹凸棒石基抗菌剂可以显著提高血液中T-AOC、SOD和CAT的活性。以上结果均与本试验结论相似,证明了在锦鲤饲料中添加适量的凹凸棒石,能够提高锦鲤的抗氧化能力。

3.2 不同凹凸棒石水平对锦鲤非特异性免疫指标的影响

鱼类属于低等脊椎动物,但也有非特异性免疫,只是与高等脊椎动物不同的地方在于,因其较低的免疫进化程度,鱼类主要依靠非特异性免疫来发挥其在免疫应答过程中的作用[25-26]。在细胞分化、溶解的过程中,磷酸酶发挥着关键作用,同时ACP还是巨噬细胞溶酶体酶的标志酶,具有重要的免疫和防御功能。张瑞强[9]研究证明,在团头鲂的饲料中加入载锌凹凸棒石,能够显著提高团头鲂血浆中ACP的活性,缓解运输对其造成的应激反应。程浩[27]研究发现,在肉鸡饲粮中添加不同水平的凹凸棒石负载植物精油复合物,可以提高肉鸡血浆中AKP的活性,但活力随着凹凸棒石负载植物精油复合物的增加达到峰值后开始下降。本试验研究表明,非特异性免疫指标与凹凸棒石添加水平有一定的相关性,想要提高锦鲤AKP及ACP活性,可以在饲料中添加适量凹凸棒石,但当凹凸棒石添加水平超过最适范围,各指标活性均从峰值开始下降,这与前人的研究结果相似,说明在饲料中添加适量的凹凸棒石可以增强锦鲤的非特异性免疫能力。

GOT和GPT是动物体内两种重要的转氨酶,它们可作为评价肝细胞损伤或坏死的最可靠指标,GOT和GPT通常存在于许多器官或组织中,如肝脏、心脏和血液,特别是在肝中的含量最高[28]。血清中GOT和GPT活性通常很低,它们在非必需氨基酸的合成以及蛋白质的代谢中起着十分重要的中介作用[29]。但是当肝脏受损时,细胞膜的通透性增加,转氨酶释放到血清中的速率加快,从而使得血清转氨酶活性提高,这是由于细胞膜的屏障作用,所以当GPT和GOT活性出现升高时,则表明动物肝脏受损[30]。Lv等[31]报道,在日常饲料中添加2 000 mg/kg的凹凸棒石,可以显著降低仔猪血清GPT活性,根据研究人员推测,这可能是由于凹凸棒石的添加导致减少了对肝脏的损害,该结果表明凹凸棒石对幼猪的肝脏有保护作用;张瑞强等[9]研究发现,在饲料中加入载锌凹凸棒石,运输应激后团头鲂血浆中GPT活性显著低于对照组,减少了运输应激对于团头鲂的肝脏损伤。本试验研究表明,与对照组相比,试验组血清和肝脏中的GOT和GPT活性均有所降低,但过量添加凹凸棒石则会产生一定的负面影响,这与以上结果相似,证明添加适量凹凸棒石可以有效保护锦鲤的肝功能,减少肝脏的损伤。

4 结论

本试验条件下,由试验结果可以得出以下结论:在饲料中添加3%～5%的凹凸棒石能够增强锦鲤的抗氧化能力及免疫能力;在饲料中添加5%的凹凸棒石可保护锦鲤肝功能不受损伤。综上所述,在本试验条件下,凹凸棒石的最适添加量为3%～5%。