敏咳方通过Wnt/β-catenin 信号通路及免疫因子动态变化对哮喘大鼠气道上皮屏障修复作用的研究

许洋洋 王文丽

支气管哮喘简称哮喘, 是一种由多种细胞和细胞成分介导的过敏性疾病, 以患者慢性气道炎症为特征,其中气道重塑是哮喘最重要的病理改变之一, 其主要发病机制是气道炎症和免疫调节机制失衡, 其呈现渐进发展, 是导致不可逆气流受限和持续性气道高反应的重要因素, 也是患者出现激素抵抗的关键原因, 最终诱发慢性难治性哮喘。研究表明, 细胞中存在复杂的信号转导途径, Wnt7B/β-catenin 信号通路存在于许多组织和细胞的增殖和分化中, 通过调节各种细胞的代谢、生长、增殖、凋亡和其他生命活动, 调节炎症介质、细胞因子和粘附因子对机体的影响, 参与哮喘气道重塑, 对哮喘气道炎症和重塑具有非常重要的作用,最新研究发现, 其在哮喘的气道炎症和重塑中起着非常重要的作用［1-3］。近几年, 中医中药治疗哮喘效果显著。基于此, 本文选取36 只无特定病原体级健康雄性SD 大鼠, 研究敏咳方通过Wnt/β-catenin 信号通路及免疫因子动态变化对哮喘大鼠气道上皮屏障的修复作用, 研究报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 选取36 只无特定病原体级健康雄性SD大鼠(辽宁长生生物有限公司提供), 随机分为正常对照组、模型组、激素治疗组、敏咳方治疗组, 每组9 只。本研究获得本院伦理委员会审核批准。

1. 2 方法 正常对照组大鼠不施加任何干预因素,自由食水, 采用0.9%氯化钠溶液进行对比实验。模型组大鼠采用卵清蛋白氢氧化铝溶液致敏并激发, 将大鼠放于清洁动物房内室温下常规饲养7 d, 自由食水, 记录大鼠体重、呼吸、进食水量、肛温情况, 实验开始第1 天与第8 天腹腔注射卵清蛋白(国药编号69003835, 原厂货号69003835, 国药集团)氢氧化铝溶液(国药编号20001060, 原厂货号20001060, 国药集团)1 ml(内含卵蛋白100 mg 及氢氧化铝200 mg), 致敏大鼠, 第15 天开始, 隔日卵清蛋白生理盐水溶液雾化14 次, 激发大鼠, 每次激发时间为20 min, 对大鼠进行风痰瘀哮喘模型建立, 取其肺常不足, 肺虚易感外风：烟熏法使大鼠感受外风, 以高脂饮食、长期激怒法致肝风内动、痰瘀互结。激素治疗组大鼠在模型组基础上加激素进行治疗, 造模第16 天起开始给药, 大鼠放入透明雾化箱中, 喷入吸入用布地奈德混悬液(商品名：普米克令舒)生理盐水溶液, 吸入量为0.06 ml/100 g体重, 浓度为20%, 1 次/d, 共15 d。敏咳方治疗组大鼠在模型组基础上加敏咳方进行治疗, 造模第16 天起开始给药, 雾化攻击前30 min 灌胃给药, 非雾化日常规给药, 连续给药15 d。敏咳方：麻黄10 g、黄芩10 g、杏仁10 g、石膏5 g、蝉衣10 g、地龙10 g、僵蚕10 g、钩藤10 g、白芍10 g、半夏10 g、陈皮5 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、黄芪10 g、白术10 g、防风10 g、甘草5 g、生地黄10 g、玄参10 g、麦冬10 g。模型组、激素治疗组、敏咳方治疗组每日灌胃等效剂量, 1 次/d,共15 d。正常对照组灌胃等量生理盐水。造模30 d 各模型组大鼠继续卵清蛋白致敏, 继续激怒、烟熏、高脂饮食、给药, 造模15 d。造模第45 天(迁延期), 各组随机取2 只大鼠取材检测指标。

1. 3 观察指标 比较四组大鼠Wnt7B、β-catenin 及支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度、OVA-sIgE 水平。采用图像分析技术测定大鼠支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度, ELISA 法检测血清OVA-sIgE 水平,qRT-PCR 法测定Wnt7B、β-catenin 的表达。①支气管壁厚度和平滑肌厚度的检测, 选取每只大鼠3 支直径为1～1.5 mm 的支气管, 使用医学图像分析软件(ImageproPlus)测定大鼠肺组织内支气管总面积(Wat1)、支气管管腔面积(Wat2)、支气管基底膜周径(Pbm)、平滑肌内缘内气管面积(Wam2)和平滑肌外缘内气管面积(Wam1), 用支气管基底膜周径做标准化处理, 其中支气管壁厚度=(支气管总面积-支气管管腔面积)/支气管基底膜周径；支气管平滑肌厚度=(平滑肌外缘内气管面积-平滑肌内缘内气管面积)/支气管基底膜周径。采用qRT-PCR 法检测Wnt7B、β-catenin 表达,按照试剂盒(北京伊塔)说明, 将大鼠肺组织总核糖核酸(RNA)用匀浆器将组织磨碎, 加入TRIzol 处理组织。5 min 后加入氯仿, 以12000 r/min 离心5 min 后测定RNA 浓度及纯度, 根据浓度取2 μg 总RNA, 按照试剂盒操作说明, 将RNA 反转录为互补的脱氧核糖核酸(cDNA), 取其产物以20 μl 反应体系进行PCR 扩增, 每个样本设3 个复孔, 以95℃预变性90 s, 95℃退火5 s,58℃延伸30 s, 共40 个循环, 获得各样本待测基因的Ct 值后用2-ΔΔCt法进行数据处理, 计算正常对照组相对于模型组、激素治疗组、敏咳方治疗组的基因表达倍数变化。ELISA 法检测血清OVA-sIgE 的表达, 按照试剂盒(上海鑫乐生物)说明书操作步骤, 利用酶标仪按照450 nm 波长测量各孔的OD 值, 按照标准曲线计算样品OVA-sIgE。以上指标检测在辽宁中医药大学病毒实验室完成, 动物实验于辽宁中医药大学实验动物中心完成。

1. 4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 (±s)表示,采用t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 四组大鼠Wnt7B、β-catenin比较 模型组Wnt7B、β-catenin 的表达均大于正常对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；激素治疗组Wnt7B、β-catenin 的表达均小于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；敏咳方治疗组Wnt7B、β-catenin 的表达均小于激素治疗组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 四组大鼠Wnt7B、β-catenin 比较( ±s)

表1 四组大鼠Wnt7B、β-catenin 比较( ±s)

注：与正常对照组比较, aP＜0.05；与模型组比较, bP＜0.05；与激素治疗组比较, cP＜0.05

组别只数Wnt7Bβ-catenin正常对照组9 1.00±0.011.00±0.01模型组910.03±1.23a 1.95±0.27a激素治疗组9 5.32±0.42b 1.42±0.18b敏咳方治疗组9 4.93±1.03c 1.33±0.21c

2. 2 四组大鼠支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比较 模型组支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度大于正常对照组, OVA-sIgE 水平高于正常对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；激素治疗组和敏咳方治疗组支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度小于模型组, OVA-sIgE 水平低于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；敏咳方治疗组支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度均小于激素治疗组, OVA-sIgE 水平低于激素治疗组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 四组大鼠支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比较( ±s)

表2 四组大鼠支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比较( ±s)

注：与正常对照组比较, aP＜0.05；与模型组比较, bP＜0.05；与激素治疗组比较, cP＜0.05

组别只数支气管管壁厚度(μm2/μm)支气管平滑肌厚度(μm2/μm)OVA-sIgE(ng/ml)正常对照组927.44±2.9212.58±0.9932.12±3.92模型组9 58.12±7.71a 25.38±1.56a 117.22±19.21a激素治疗组9 41.51±3.39b 22.27±0.91b 67.59±7.92b敏咳方治疗组9 37.12±3.21bc 20.11±0.89bc 59.51±6.39bc

3 讨论

支气管哮喘是一种涉及多种炎症细胞和细胞因子的异质性疾病, 以气道高反应性和气道炎症为主要特征的、严重危害公众健康的呼吸道疾病, 其特征是慢性气道炎症和气道重塑, 其临床表现包括患者出现阵发性喘息、呼吸短促、胸闷、咳嗽等［4］。哮喘的发生与患者气道炎症和气道重塑密切相关, 其中气道炎症的持续发作介导炎症细胞对气道黏膜下层的趋化性,气道上皮的反复损伤和修复, 导致气道成纤维细胞过度增殖和转化, 最终导致气道重塑, 并且气道成纤维细胞的过度增殖也会促进纤维粘蛋白和胶原的合成, 从而损害纤毛清除和局部防御功能, 导致大量病原菌生长繁殖, 而加重气道炎症［5,6］。气道滞留的黏液为细菌生长提供了良好的培养基, 容易引起呼吸道感染, 难以控制［7,8］。哮喘被认为是一种与适应性免疫应答激活有关的疾病, 其最突出的表现是Th2 细胞依赖性促进免疫球蛋白产生, 其中Wnt/β-catenin 信号通路与哮喘气道炎症密切相关, 并且哮喘还以先天性免疫反应为特征, 影响树突状细胞(DC 细胞)的转运、先天性免疫细胞因子的产生、淋巴细胞的启动, 其均与Wnt/β-catenin 信号转运密切相关, Wnt/β-catenin 信号通路与哮喘气道重塑也密切相关［9,10］。相关研究发现,β-catenin 可通过过度的支气管拉伸β-catenin 激活,并通过细胞增殖参与哮喘的组织修复, 气道上皮细胞分化和细胞外基质生成, 因此, β-catenin 激活是气道重塑的关键机制［11］。Wnt7B 是Wnt 信号通路配体之一, 主要在肺组织上皮中表达, 在胚胎期参与肺发育,其可调节肺平滑肌细胞的发育, 其表达失衡与气道重塑密切相关［12］。哮喘属于中医“哮病”的范畴, 其主要病机为“伏痰”内结, 遇感引触, 壅阻肺气, 肺失宣肃, 气道挛急。课题组多年的儿科临床及科研发现, 与普通外感疾病急性期邪实、恢复期正虚病机演变规律不同, 儿童哮喘的发病体现了虚实夹杂的病机特点。风(内风、外风)、痰瘀、虚(气虚、阴虚)是导致哮喘反复发作、缠绵难愈的病机关键, 贯穿哮喘疾病发病始终。小儿为稚阴稚阳之体, 素体肺常不足, 肺虚易感外风, 哮喘患儿病初见鼻塞、咽痒、流涕、鼻痒, 为外风袭肺。采用咳敏方对大鼠进行治疗, 蝉衣、地龙、僵蚕、钩藤熄风；白芍养肝柔肝；麻黄、黄芩、杏仁、石膏为《伤寒论》名方, 治疗哮喘效果显著；半夏、陈皮、茯苓健脾化痰；黄芪、白术健脾；生地黄、玄参、麦冬滋阴；牡丹皮、赤芍清热凉血；防风疏散风热；甘草调和诸药。以上药物同用起到滋阴、清热、健脾、息风、止喘的作用。

实验中qRT-PCR 法测定Wnt7B、β-catenin 的表达, 结果显示, 模型组Wnt7B、β-catenin 的表达均大于正常对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；激素治疗组Wnt7B、β-catenin 的表达均小于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)；敏咳方治疗组Wnt7B、β-catenin 的表达均小于激素治疗组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。由此可见激素治疗和中药咳敏方治疗均可以抑制Wnt7B、β-catenin 的表达, 但是咳敏方效果更加显著。实验中大鼠支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度及ELISA 法检测血清OVA-sIgE 水平, 结果显示, 模型组支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度大于正常对照组, OVA-sIgE 水平高于正常对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；激素治疗组和敏咳方治疗组支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度小于模型组, OVAsIgE 水平低于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；敏咳方治疗组支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度均小于激素治疗组, OVA-sIgE 水平低于激素治疗组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。由此可见激素治疗可以对大鼠支气管管壁厚度、支气管平滑肌厚度有改善作用,可降低血清OVA-sIgE 水平, 敏咳方治疗组优于激素治疗组。

综上所述, 敏咳方通过Wnt/β-catenin 信号通路及免疫因子动态变化调节哮喘大鼠气道上皮屏障修复作用, 疗效显著。