外周血microRNA-27a 与缺血性脑卒中的相关性及诊断价值分析

赵乐 杨挲挲 陈志会 查江杰 李梦真 程铭 韩鹏飞

缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)又被称之为脑梗死, 主要由颅内动脉狭窄和大脑中动脉闭塞引起［1］, 是一种因大脑供血供氧不足而引起的疾病。每年,脑血管破裂、缺血或中风导致全球超过4000 万人残疾［2］, IS 是当前导致成年人瘫痪或者残疾的一个主要诱因［3］。微小RNA(miRNA)是一类基因序列高度保守的内源性核苷酸非编码RNA, 其与靶基因mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)发生特异性结合之后, 会对蛋白质翻译产生一定的抑制作用, 甚至还会导致蛋白质发生降解, 在转录后对蛋白质的表达起到一定的调节控制作用, 这对于基因表达的调节控制是至关重要的［4］。microRNA-27a 在调节多种疾病的发生和发展中起作用, 在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等肿瘤细胞中的表达水平显著上调［5-8］, 调控肿瘤的发生和发展。然而microRNA-27a 在IS 中的相关研究成果还不是很多。本研究通过测定microRNA-27a 在IS 患者和健康对照者外周血中的差异表达, 分析外周血中microRNA-27a的相对表达量与NIHSS 评分是否具有相关性以及对IS的诊断效能, 旨在为IS 探索新型生物标志物及潜在的治疗靶点。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2021 年9 月～2022 年7 月在牡丹江医学院附属红旗医院神经内科确诊为IS 的90 例患者作为IS 组, 根据NIHSS 评分不同分为轻度组(0～4 分)、中度组(5～13 分)和重度组(14～42 分), 每组30 例；选择同期体检中心45 例健康体检者为对照组。IS 组中男58 例, 女32 例；平均年龄(60.40±5.76)岁。对照组中男27 例, 女18 例；平均年龄(59.56±4.68)岁。IS 组和对照组一般资料比较, 差异无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。本研究所有受试者均知晓研究目的、主要内容和具体方法等, 并签订知情同意书；本研究获得牡丹江医学院附属红旗医院伦理委员会批准。IS 组纳入标准：①符合《各类脑血管疾病诊断要点(1995 年版)》中明确的IS 诊断标准, 且根据临床资料和磁共振成像(MRI)首次诊断为IS；②年龄45～70 岁；③签订知情同意书。对照组纳入标准：①年龄45～70 岁；②既往无IS 或短暂性脑缺血(TIA)、无急性冠状动脉综合征等心血管疾病的同期体检中心体检的健康人群。排除标准：①有脑卒中或脑外伤既往史者；②短暂性脑缺血发作；③出血性脑卒中和脑肿瘤患者；④肺纤维化、内分泌代谢疾病、免疫或炎症性疾病、慢性心血管、肝肾功能损伤者。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要试剂 三氯甲烷、异丙醇和无水乙醇均由国药集团化学试剂公司提供, TRIpure Total RNA Extraction Reagent、EntiLink™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 和EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix试剂盒购自ELK Biotechnology。

1. 2. 2 RNA 提取 量取体积为500 μl 的全血置于体积规格为15 ml 的离心管中, 之后加入10 倍体积的红细胞裂解液, 充分混匀, 常温避光10 min。之后在常温条件下对300 g 的混合液进行10 min 的离心处理, 弃掉上清液, 之后再重复操作1 次。利用磷酸缓冲液(PBS)对细胞液进行重悬, 之后在常温条件下对300 g 的混合液进行10 min 的离心处理, 弃掉上清液, 使用体积为100 μl的 PBS 对细胞再次进行重悬, 加入体积为1 ml 的TRIpure 溶液, 充分混匀, 常温避光5 min, 加入体积为250 μl 的三氯甲烷溶液, 缓慢摇晃直至混合均匀, 在冰块上静置5 min。在温度为4℃的条件下对10000 g 的混合溶液进行10 min 的离心处理。之后在超净工作台上抽取体积为500 μl 的上清液, 将其转移到1.5 ml 的EP 管中, 然后加入在温度为4℃的条件下经过预冷处理的500 μl 的异丙醇, 缓慢摇晃直至混合均匀, 置于温度为-20℃的条件下静置15 min。在温度为4℃的条件下对10000 g 的混合溶液进行10 min 的离心处理, 然后去掉上清液, 加入1 ml 在温度为4℃的条件下经过预冷处理的75%乙醇, 缓慢颠倒摇晃多次之后, 使用缓冲液清洗RNA 沉淀, 在温度为4℃的条件下对10000 g的混合溶液进行5 min 的离心处理, 弃掉上清液后转移到超净工作台上进行干燥处理, 几分钟后待乙醇完全挥发, 加入体积为100 μl 的RNase-Free Water, 使RNA得到充分溶解。

1. 2. 3 第一链cDNA 合成 第一链cDNA 的合成借助于EntiLink™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒完成,在冰上完成反应溶液的配制工作后, 之后转移到温度为70℃的PCR 仪上反应5 min, 再迅速放到冰块上静置2 min；在冰上完成反应溶液的配制工作后, 之后转移到温度为42℃的PCR 仪上反应60 min, 之后转移到温度为85℃的PCR 仪上反应5 min, 最后置于温度为4℃的条件下保存。

1. 2. 4 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR 是在Life technologies公司的QuantStudio 6 Flex System PCR仪上完成, 每个样品都准备3 个复孔, 借助于EnTurbo™SYBR Green PCR SuperMix 试剂盒完成, 本研究以H-U6作为内参基因, 运用2-ΔΔCT法分析每个样品中目的基因相对表达量。扩增条件设定为：预变性95℃, 30 s,循环(40 次)95℃, 10 s →58℃, 30 s →72℃, 30 s, 采用仪器默认的熔解曲线来分析程序。各基因的引物序列见表1。

表1 各基因的引物序列

1. 3 观察指标 对比IS 组与对照组外周血microRNA-27a 相对表达量, IS 组不同病情严重程度患者外周血microRNA-27a 相对表达量；分析IS 患者外周血microRNA-27a 相对表达量与NIHSS 评分的相关性, microRNA-27a 对IS 的诊断效能。

1. 4 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验；采用Pearson 相关系数进行相关性分析；运用GraphPad Prism 8 软件绘制ROC 曲线, 评估microRNA-27a对IS 的诊断效能。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 IS 组与对照组外周血microRNA-27a 相对表达量对比 IS 组外周血microRNA-27a 相对表达量为(0.77±0.54), 显著低于对照组的(1.76±1.26), 差异具有统计学意义(P＜0.001)。见图1。

图1 两组外周血microRNA-27a 相对表达量对比

2. 2 IS 组不同病情严重程度患者外周血microRNA-27a相对表达量对比 轻度组患者外周血microRNA-27a相对表达量为(1.08±0.66), 中度组为(0.75±0.27), 重度组为(0.48±0.45)。轻度组患者外周血microRNA-27a相对表达量高于中度组、重度组, 中度组高于重度组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 轻、中、重度组外周血microRNA-27a 相对表达量对比

2. 3 IS 患者外周血microRNA-27a 相对表达量与NIHSS 评分的相关性分析 Pearson 相关性分析显示：IS 患者外周血microRNA-27a 相对表达量与NIHSS 评分呈负相关关系(r=-0.54, P＜0.01)。见图3。

图3 IS 患者外周血microRNA-27a 相对表达量与NIHSS 评分的相关性分析

2. 4 microRNA-27a 对IS 的诊断效能分析 将IS 作为状态变量, 将microRNA-27a 作为检验变量, 结果显示：microRNA-27a 的AUC 为0.818, 截断值为0.965,特异度为75.60%, 灵敏度为76.70%。见图4。

图4 microRNA-27a 对IS 诊断效能的ROC 曲线

3 讨论

IS 是发展中国家和发达国家致残和死亡的第二大原因, 自2010 年以来, 每年约有550 万人死亡, 预计到2030 年将增加24.9%, 而且50%的幸存者患有慢性残疾, 同时IS 的发病率也正在增加, 全球≥65 岁人口的增长速度快于所有其他年龄组, 此外, 脑卒中患病风险正在向较年轻人群转移, 特别是在低收入和中等收入国家［9］, 这给卫生保健系统带来了巨大的财政负担。目前, 诊断IS 主要依靠的是脑影像学检查和典型临床症状, 但是约50%的IS 在影像学诊断中缺乏特异性, 而且影像学检查会对患者的身体造成一定的损伤, 其安全性低于分子生物学检查［10］, 此外, 还尚无单独诊断IS 的高效且特异的血液学生物标志物应用于临床［11-13］。然而, 药物和手术治疗对IS 的有益效果有限, IS 的主要治疗方法是立即恢复血液供应, 但这可能会加剧脑缺血再灌注损伤 (IRI) 引起的脑损伤［14］, 虽然重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)一直是挽救缺血组织的中流砥柱, 但由于治疗窗口窄、经济支出高和出血相关并发症的局限性, 只有少数IS 患者能够真正从中受益［15］。因此, 探索IS 的新型生物标志物至关重要, 旨在为IS 的治疗提供新的方向。

microRNA-27a 位于人类19 号染色体［16］, 具有相对稳定性、特异性和可重复性的特性［17］, 所以是IS 比较有前途的生物标志物, 比蛋白更适合用于疾病的诊断。目前, 国内外学者对microRNA-27a 的研究大多数都是围绕恶性肿瘤疾病开展的, 在心脑血管疾病及IS 相关危险因素疾病中意义的研究也比较多, 而对于IS 的相关研究相对较少, 且大多数研究者采用的都是动物模型(MCAO 模型)和体外细胞模型氧葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型对IS 进行研究, 在IS患者外周血中的研究几乎还处于空白阶段。本研究结果显示, 运用实时荧光定量PCR 测定IS 患者和健康者外周血microRNA-27a 的表达水平, IS 组外周血microRNA-27a 相对表达量为(0.77±0.54), 显著低于对照组的(1.76±1.26), 差异具有有统计学意义(P＜0.001)。表明, IS 患者外周血microRNA-27a 相对表达量低, 这与Li 等［18］、Dai 等［19］和Liu 等［20］的研究结果一致。IS 组根据NIHSS 评分不同分为轻度组、中度组、重度组, 轻度组患者外周血microRNA-27a 相对表达量为(1.08±0.66), 中度组为(0.75±0.27), 重度组为(0.48±0.45)。轻度组患者外周血microRNA-27a 相对表达量高于中度组、重度组, 中度组高于重度组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。Pearson 相关性分析显示：IS患者外周血microRNA-27a 相对表达量与NIHSS 评分呈负相关关系(r=-0.54, P＜0.01)。表明, IS 患者外周血中microRNA-27a 表达水平有助于判断疾病的严重程度, IS 患者的病情越严重, 外周血中microRNA-27a 表达水平越低。绘制ROC 曲线来评估IS 患者外周血中microRNA-27a 的诊断效能, 以此来判断microRNA-27a作为诊断IS 的生物标志物的潜力, 结果显示,microRNA-27a 的AUC 为0.818, 截断值为0.965, 灵敏度为76.70%, 特异度为75.60%, 证明microRNA-27a 对IS 的诊断效能尚可, 外周血microRNA-27a 有望成为诊断IS 的新型生物标志物。

microRNA 作为脑卒中未来的靶向治疗手段, 其疗效优于传统的治疗方法, 靶向基因治疗的潜力不仅在神经保护诱导方面更先进, 而且在更安全无毒的靶向治疗方面也更先进［4］。然而, 目前对外周血microRNA-27a 在IS 中的研究仅处于初步探索阶段, 对其在IS 中的保护或损伤机制还尚未可知。Cai 等［21］研究结果发现, 在IS 体外细胞模型中, microRNA-27a 通过靶向FOXO1 来抑制IRI, 所以外周血microRNA-27a在IS 中调控的靶基因和完整的靶向轴还需要未来大量的临床样本和实验研究来验证, 以期为IS 的治疗提供新的思路。部分蛋白标志物与IS 的脂质代谢异常、炎症反应等存在相关性, 对IS 进行早期辅助诊断和预后评估等方面具有重要意义。在以往的研究中, 对于microRNA 和蛋白标志物联合检测的文献还比较少, 因此, 探寻在IS 中与外周血microRNA-27a 表达水平具有相关性的蛋白标志物, 并且与其进行联合检测或可提高对IS 的诊断效能。

综上所述, microRNA-27a 与IS 的发生有关, IS 患者外周血microRNA-27a 相对表达量低于健康者；外周血microRNA-27a 相对表达量有助于判断IS 患者的病情严重程度, 且对IS 具有一定的诊断价值。所以,microRNA-27a 在作为IS 的血液学生物标志物和有效的治疗手段方面具有巨大潜力。