龟板固本方对肺癌骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响

张广丽,黎壮伟,宋 卉

(广东食品药品职业学院,广东 广州 510000)

化疗仍然是目前治疗肺癌的主要手段之一,该疗法可抑制和杀伤肺癌细胞,但由于多数化疗药物对肺癌细胞特异性并不高,在杀伤肺癌细胞的同时也破坏了机体的正常细胞,造成骨髓抑制[1],患者常出现贫血、白细胞下降或者血小板下降。所以加强肺癌化疗者骨髓造血功能保护成为癌症治疗领域的重要目标。龟板固本方是治疗肿瘤相关性贫血的有效经验方,课题组前期研究证实该方可有效防治骨髓抑制[2-3],推测其可能是通过作用于细胞DNA周期,参与受损伤的细胞DNA修复,并调控细胞凋亡相关蛋白,进而改善骨髓的抑制程度。为验证这一假说是否正确,本课题组通过动物实验,从骨髓细胞DNA周期损伤修复及调控凋亡相关蛋白表达的角度,研究了龟板固本方对肺癌化疗小鼠骨髓抑制的影响。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级C57BL/6小鼠60只,体重18～22 g,购于北京华阜康科技股份有限公司[生产许可证号:SCXK(京)2019-0008]。动物在SPF 级屏障环境动物房分笼饲养,5只/笼,自由摄食饮水,室温(21±2)℃,湿度30%～60%,照明时间12 h,换气次数>10次/h。本实验过程遵循2006年国家科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2细胞株及药品 Lewis肺癌瘤株购于中国科学院上海生命科学生物化学与细胞生物学研究所。龟板固本方由龟板15 g、黄精30 g、桑椹30 g、黄芪30 g、红参10 g组成,中药饮片购自广州致信药业股份有限公司,按常规方法水煎取汁浓缩,实验用药生药含量为0.8 g/mL,置冰箱4 ℃保存备用。注射用环磷酰胺由江苏盛迪医药有限公司生产,国药准字H32020857,规格:0.2 g/瓶。重组人粒细胞刺激因子注射液,杭州九源基因工程有限公司生产,国药准字S10980029,规格:75 μg/支。

1.3主要试剂与仪器 Bcl-2、Bax抗体(英国Abcam公司);碘化丙啶(北京百奥莱博科技有限公司)。RNA酶(Roche公司); IMDM培养液(HYCLONE公司,批号: NWB0372)。Napco-5410 CO2培养箱 (美国Shelden公司) ;全自动立式电热压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-SⅡ);UV2101 PC型紫外分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)。荧光显微镜(Leica Microsystems Ltd,德国);流式细胞仪(美国BECKMAN-COULTER公司)。

1.4实验方法 将60只小鼠随机分为空白组、模型组、龟板固本方组、粒细胞刺激因子组,每组15只。除空白组外,其他3组小鼠均进行肺癌骨髓抑制造模。具体方法:取对数生长期的Lewis肺癌细胞,常规离心,制成瘤细胞混悬液,消毒小鼠右前腋,取0.2 mL接种于皮下。待瘤体生长至直径1～1.5 cm时,处死小鼠,选取生长良好的瘤组织,剪碎、称重,用细胞匀浆器制成匀浆,制备成浓度为1×107/mL瘤细胞混悬液,每只小鼠右腋下接种0.2 mL[约(1～2)×106瘤细胞],接种4 d后,以小鼠右腋下皮下可触及肿瘤块标志肺癌造模成功。然后对肺癌造模成功小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺250 mg/kg(于临用前配制),以外周血WBC、RBC、Plt明显低于正常小鼠提示肺癌骨髓抑制模型复制成功[1]。造模完成后24 h,龟板固本方组按0.4 mL/d的剂量灌胃龟板固本方悬液,空白组和模型组灌胃等量生理盐水,粒细胞刺激因子组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液5 ng/g,均1次/d,连续干预7 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1骨髓细胞周期 最后1次干预24 h后,经颈椎脱臼处死各组小鼠,取左侧股骨,用剪刀剪开股骨两头,露出骨髓腔,然后用消毒过的注射器(4号针头)吸取2 mL培养液,反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,全部置离心管内,反复吹打使细胞完全分散,然后1 000 r/min离心10 min,去上清,加入适量培养液充分混匀,制成骨髓有核细胞悬液。加入1 mL冰浴预冷70%乙醇中,轻轻吹打混匀,4 ℃固定12 h,用PBS漂洗2次后,加100 μL PBS混匀,加入浓度为50 μg/mL的碘化丙啶染色液,37 ℃避光温浴30 min,4 ℃避光存放。流式细胞仪检测各组小鼠骨髓细胞周期。

1.5.2细胞凋亡相关蛋白表达情况 取各组小鼠右侧股骨,4%多聚甲醛固定24 h,20% EDTA脱钙,常规脱水、透明、浸蜡、切片,用免疫组化SP法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达情况。摄像显微镜下观察,Bcl-2和Bax阳性表达为细胞质呈棕黄色,无棕黄色为阴性表达。每张切片随机选取5个视野,计数每个视野阳性细胞数,取其平均值为每张切片阳性细胞数。Bcl-2和Bax表达情况以阳性细胞所占比例和染色强度进行测定,阳性细胞所占比例评分标准: 阳性细胞数1%～25%为1分,26%～50%为2分, 51%～75%为3分, 76%～100%为4分。染色强度:无色0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。以两项评分的乘积作为最终的判断结果,≤7分为阴性,>7分为阳性。

2 结 果

2.1各组小鼠骨髓细胞周期比较 与空白组比较,模型组G0/G1期和S期细胞比例明显升高(P均<0.05),G2/M期细胞比例明显降低(P<0.05);与模型组比较,龟板固本方组和粒细胞刺激因子组G0/G1期细胞比例均明显降低(P均<0.05),S期和G2/M期细胞比例均明显升高(P均<0.05);与粒细胞刺激因子组比较,龟板固本方组S期细胞比例较低(P<0.05),G0/G1期和G2/M期细胞比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和肺癌骨髓抑制各组小鼠骨髓细胞周期比较

2.2各组小鼠骨髓细胞凋亡蛋白表达情况比较与空白组比较,模型组Bax蛋白表达量明显升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,龟板固本方组和粒细胞刺激因子组Bax蛋白表达量均明显降低(P均<0.05),Bcl-2蛋白表达量均明显升高(P均<0.05);与粒细胞刺激因子组比较,龟板固本方组Bcl-2蛋白表达量较低(P<0.05),Bax蛋白表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 空白组和肺癌骨髓抑制各组小鼠骨髓细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达量比较

3 讨 论

骨髓抑制是肺癌药物治疗过程中常见的不良反应,目前仍没有非常有效的预防方法,主要是骨髓抑制发生后采用促红细胞生成素、重组人粒细胞刺激因子、白细胞介素-11等选择性作用于造血祖细胞,促进其增殖、分化,改善骨髓抑制,但其作用时间比较短暂,不能长期有效解决骨髓抑制问题。细胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与合成后期(G2期)、细胞分裂期(M期),骨髓细胞周期的分布情况是骨髓造血功能的重要指标,可以反映骨髓增殖的状态。当化疗使造血细胞DNA受到损伤后,骨髓细胞周期阻滞于G1期来修复损伤的DNA,对不能修复者启动凋亡程序消除受损细胞。因此,解除骨髓细胞G1期阻滞,使细胞由G1期转入S期,进而使S期向G2/M期转化是拮抗放、化疗药物造成骨髓抑制的一个重要机制[4-5]。造血干细胞数量减少与骨髓细胞凋亡增加有关[6]。细胞凋亡受到一系列相关基因的调节和控制,其中Bcl蛋白家族为细胞凋亡的主要调节者[7],按其作用不同分为抗凋亡和促凋亡两大类[8-9]。Bcl-2属于抗细胞凋亡因子,其表达增强,可抑制骨髓细胞凋亡;Bax属于促细胞凋亡因子,其表达增强,可促进细胞凋亡。有研究表明,中药具有干预细胞增殖,促进细胞凋亡的作用,例如青藤碱可抑制786-O细胞增殖,诱导细胞周期G1/S期阻滞,调节786-O细胞中cmyc的表达水平,诱导凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达上调,促进细胞凋亡[10]。中药复方益髓理血饮能下调骨髓增生异常综合征大鼠Bax表达,上调Bcl-2表达,减少骨髓细胞凋亡[11]。

骨髓抑制表现为血液不足或血液的濡养功能减退,患者可见精神疲倦、乏力、头晕、面色苍白或萎黄、唇甲苍白、气促、心悸、失眠、多梦、手脚麻木,舌质淡,脉细无力,中医可按“血虚证”进行辨证论治。中医认为, 脾和肾与血的生成关系最为密切,血液来源于经中焦脾胃所化生的水谷精微,如《灵枢·决气》所说:“中焦受气,取汁,变化而赤,是谓血。”肾者主水,受五脏六腑之精而藏之,精能生血。《诸病源候论》指出:“肾藏精,精者,血之所成也。”范先基等[12]研究表明,健脾益肾补血法能够明显改善肺癌化疗者骨髓造血功能,提高外周血白细胞计数、中性粒细胞计数、红细胞计数、血小板计数及血红蛋白等。刘杰等[13]研究显示,健脾益肾颗粒不但能促进骨髓有核细胞分裂,保护造血干细胞,而且能通过提高细胞免疫功能,补充营养物质和微量元素等多种途径而发挥生血作用。马晶洁等[14]研究结果显示,化疗期间配合使用健脾补肾方可改善贫血,提高患者的生活质量。由此可见,健脾补肾是治疗骨髓抑制的主要原则。龟板固本方具有健脾补肾、填精益髓的功效。前期动物实验证实,龟板固本方能明显提升肺癌骨髓抑制小鼠外周血白细胞、血小板和红细胞计数,能提高骨髓造血微环境的促红细胞生成素 、血小板生成素、粒细胞集落刺激因子含量[15],从而改善骨髓抑制,促进骨髓细胞分化增殖。

本实验结果显示,与空白组比较,模型组G0/G1期和S期细胞比例显著升高,G2/M期细胞比例显著降低,表明化疗不仅引起G1期阻滞,而且还造成S期阻滞;与模型组比较,龟板固本方组G0/G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高,表明龟板固本方可能通过解除细胞G0/G1期和S期阻滞,促使G1期细胞进入S期,使S期细胞向G2/M期细胞转化,从而促进骨髓细胞增殖,改善骨髓抑制。同时模型组Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,提示化疗促进骨髓细胞凋亡;龟板固本方组Bcl-2蛋白表达上调,Bax蛋白表达下调,说明龟板固本方可调控凋亡相关蛋白的表达,从而抑制骨髓细胞凋亡。

本实验在以往临床和实验研究的基础上,进一步证实龟板固本方可通过上调Bcl-2蛋白表达和下调Bax蛋白表达,抑制肺癌骨髓抑制小鼠骨髓细胞凋亡,促进骨髓细胞增殖,为龟板固本方治疗骨髓抑制提供了实验依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。