脊髓小胶质细胞中释放ATP 的SWELL1 通道参与神经病理性疼痛

一、研究背景

神经病理性疼痛是一种常见的、使人衰弱的慢性疼痛综合征，脊髓小胶质细胞在神经病理性疼痛的发病机制中起着至关重要的作用。在周围神经损伤后，脊髓小胶质细胞被激活，并发生形态改变、增殖、信号分子（包括多种嘌呤能受体如P2X4R、P2X7R 和P2Y12R）上调。嘌呤能系统是调节小胶质细胞激活最重要的信号通路之一。当嘌呤能受体受到刺激时，小胶质细胞释放的神经调质将导致突触传递和脊髓背角神经元活动的异常。这些病理改变会加剧脊髓伤害性信息传递，并可能将非伤害性刺激转化为疼痛信号。阻断脊髓嘌呤能受体可逆转疼痛超敏反应，表明神经病理性疼痛需要细胞ATP触发的嘌呤能信号。然而，周围神经损伤后脊髓内ATP 释放增加的机制尚不清楚。

体积调控阴离子通道 (volume-regulated anion channel, VRAC) 由渗透性细胞肿胀所激活，介导氯离子和各种有机渗透物从细胞中释放，从而利于水通过渗透外排，导致调控性细胞体积下降。在肿胀细胞中检测到依赖VRAC 的ATP。然而，ATP 是通过VRAC 本身直接释放还是通过间接机制释放尚不清楚。既往研究发现鞘内注射卡贝诺洛酮（一种连接蛋白/泛连接蛋白半通道和VRAC 的非特异性阻断剂）可抑制啮齿动物的神经病理性疼痛，提示VRAC 可能参与神经病理性疼痛过程，本研究对此进行了探讨。

二、主要研究结果

1.SWELL1 依赖性VRAC 是一种ATP 释放通道

为了确定ATP 是否直接通过VRAC 通道渗透，该研究首先在表达VRAC 的HeLa 细胞中进行了实验，用等摩尔ATP 代替细胞内的Cl-作为唯一的渗透阴离子和灌注低渗溶液来激活VRAC 电流。全细胞膜片钳记录到大量的向内电流，而在敲除Swell1的细胞中由ATP 外排介导的内向电流被消除，证明SWELL1 通道对于VRAC 的ATP 通透是必要的，逆转电位的变化同样表明VRAC 通道对ATP 具有高通透性。荧光素-荧光素酶实验也检测到低渗溶液处理后HeLa 细胞外大量释放的ATP。根据电生理数据和既往敲低实验的结果，细胞肿胀可诱导野生型(WT)细胞中ATP 外排明显增加，而在Swell1敲除(KO)细胞中则无作用，并且这种ATP 释放可以被已知的VRAC 阻滞剂oxobutyric acid (DCPIB) 以剂量依赖的方式所抑制。

为了进一步测试VRAC 介导的ATP 释放是否可以被周围细胞检测到，该研究使用sniffer patch方法作为细胞外ATP 的灵敏功能性生物测定法。以HeLa 细胞为源细胞，转染P2X2R-黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP) 的人胚胎肾 (human embryonic kidney, HEK) 293T 细胞为邻近的传感器细胞进行双全细胞膜片钳记录。结果显示高渗溶液激活了WT 源细胞中的VRAC 和传感器细胞中的P2X2R，并在邻近的传感器细胞中检测到依赖VRAC的ATP 外排（约占P2X2R 完全激活的5%）。在Swell1KO 源细胞中，VRAC 电流被消除且KO 细胞中也无ATP 释放，证明依赖SWELL1 的VRAC 通道传导和释放ATP。

2.SWELL1 通道对小胶质细胞中VRAC 活性和ATP 释放至关重要

接下来该作者研究了小胶质细胞中VRAC 活性是否需要SWELL1。通过Western blot 观察到SWELL1 蛋白在小鼠BV2 小胶质细胞中高表达。低渗溶液可引起小胶质细胞产生明显的Cl-电流且具有VRAC 特征，即外向整流和DCPIB 敏感性。除了细胞肿胀，VRAC 还可以被其他生理相关的刺激激活，包括鞘氨醇-1-磷酸 (sphingosine-1-phosphate, S1P)，一种与神经病理性疼痛有关的炎症介质。S1P 在正常等渗缓冲液中诱导小胶质细胞产生DCPIB 敏感、外向整流的VRAC 电流，该作用依赖于S1P 受体和活性氧 (reactive oxygen species, ROS)的产生，且S1P 诱导小胶质细胞释放大量ATP。为了检测S1P 诱导的ATP 释放是否依赖于VRAC，使用CRISPR-Cas9 技术敲除BV2 小胶质细胞中的Swell1。S1P 处理后，VRAC 电流和ATP 外排均被阻断，说明SWELL1 是BV2 小胶质细胞中VRAC的重要亚基，可能在炎症过程中介导ATP 释放。

既往的研究显示，周围神经损伤后，脊髓细胞外ATP 水平升高。为了研究这一现象是否由小胶质细胞VRAC 通道介导，该研究使用Cx3cr1-Cre小鼠和Swell1F/F小鼠杂交，获得了小胶质细胞特异性Swell1敲除小鼠 (conditional knockout, cKO)。利用坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI) 模型，发现CCI 组中Swell1F/F对照组小鼠的腰段脊髓切片细胞外ATP 的浓度显著高于假手术组，并且Swell1cKO 小鼠CCI 后细胞外ATP 的增加被抑制，表明小胶质细胞SWELL1 通道参与CCI 后ATP 释放增加过程。Swell1cKO 小鼠细胞外ATP 水平的降低可能是由于直接通过小胶质细胞Swell1通道释放的ATP 减少，或小胶质细胞的激活被间接减少，或者很可能是两者兼而有之。

3.CCI 诱导的神经病理性疼痛样行为在小胶质细胞特异性Swell1 cKO 小鼠中减少

接下来检测了小胶质细胞SWELL1 的表达是否受周围神经损伤的调节。RNAscope 原位杂交显示小胶质细胞Swell1的表达在神经损伤的反应中有所增加。而且，小胶质细胞Swell1的缺失不影响基础痛阈，但CCI 诱导的机械性触诱发痛和热痛觉过敏消失。此外，CCI 诱导的步态异常在小胶质细胞缺失Swell1的情况下也有降低。以上结果证明小胶质细胞中的SWELL1 通道在神经病理性疼痛样行为的发病机制中起关键作用。

小胶质细胞的性别二态性及其在神经病理性疼痛中的作用已经得到证实。为了检测特异性Swell1cKO 的小胶质细胞是否也存在这种性别差异，该研究在周围神经损伤后的雌性小鼠中也进行了一系列相同的行为测试。结果显示小胶质细胞SWELL1 在调节疼痛样行为方面具有性别二态性，在雄性小鼠中比在雌性小鼠中发挥更突出的作用。这种性别差异与最近一些关于小胶质细胞在雄性小鼠而非雌性小鼠疼痛中的独特重要作用的文献一致，其潜在的机制值得进一步研究。

4.CCI 诱导的脊髓小胶质细胞增生和背角神经元过度兴奋在小胶质细胞特异性Swell1 cKO 小鼠中减少

脊髓小胶质细胞在周围神经损伤的反应中会发生显著的增殖和形态变化，这种变化对神经病理性疼痛的发展至关重要。Iba1 免疫染色观察到，生理条件下Swell1的缺失不会导致小胶质细胞异常激活，但CCI 引起的脊髓小胶质细胞的活化降低，说明SWELL1 对于CCI 诱导的小胶质细胞改变是必需的。已知活化的脊髓小胶质细胞分泌各种信号分子，包括白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)，可诱导背角神经元兴奋性增加和神经病理性疼痛。与小胶质细胞活化降低一致，CCI 后Swell1cKO 小鼠脊髓IL-1β 浓度与WT 相比显著降低，提示SWELL1 是周围神经损伤后脊髓小胶质细胞激活和促炎变化的重要调节因子。

VRAC 介导的Cl-外排已被认为是炎症小体NLRP3（NOD-，LRR-和含pyrin 结构域蛋白3）激活的重要步骤，并促进巨噬细胞分泌IL-1β。该研究通过全细胞膜片钳记录Swell1cKO 小鼠的骨髓源性巨噬细胞(BMDMs) VRAC 电流，发现SWELL1对于NLRP3 的激活是非必需的，并且VRAC 可能通过间接机制调节脊髓中的IL-1β 水平，包括小胶质细胞的激活。

SWELL1 对小胶质细胞-神经元相互作用在调节神经病理性疼痛又有何作用？该研究通过免疫荧光染色发现，CCI 后小鼠脊髓背角内的c-Fos+神经元数量增加，部分原因可能是周围神经损伤后自发性神经元活动和神经元激活增加；相比之下，Swell1cKO 小鼠CCI 后脊髓背角c-Fos+神经元的数量明显减少。II 层背角神经元在处理伤害性信息中至关重要，既往的研究表明，周围神经损伤增加II 层背角神经元突触传递和兴奋性。该研究使用全细胞膜片钳记录II 层背角神经元的自发性兴奋性突触后电流 (sEPSCs) 的振幅和频率，发现小胶质细胞Swell1敲除小鼠，CCI 诱导兴奋性突触传递增强受到抑制。这些结果说明小胶质细胞SWELL1 通道参与CCI 引起的背角神经元兴奋性增强和兴奋性突触传递增强。

5.FDA 批准的药物文库筛选并确定双香豆素是一种有效的VRAC 抑制剂

为了进一步支持遗传学研究结果，该研究通过药理抑制剂研究VRAC 在神经病理性疼痛中的功能作用。目前可用的VRAC 小分子阻滞剂往往缺乏有效性和特异性。该研究通过高通量YFP 猝灭实验和电生理筛选并鉴定出两种新的VRAC 阻滞剂：双香豆素 (dicumarol)，一种维生素K 环氧化还原酶的竞争性抑制剂；安可米 (zafirlukast)，一种半胱氨酸白三烯受体1 拮抗剂。它们可剂量依赖性快速完全抑制低渗透压诱导的VRAC 电流产生。与安可米相比，双香豆素的效力略强，且最大血清浓度 (Cmax) 远远超过它的IC50，而安可米的Cmax为亚微摩尔浓度，远低于IC50 值。因此，对双香豆素做了进一步研究。双香豆素对HEK293T 细胞中VRAC 通道和Ca2+激活的Cl-通道 (CaCC/TMEM16A) 无显著的抑制作用，但可以剂量依赖性阻断低渗透压诱导的ATP 释放并抑制VRAC 电流，表明双香豆素是一种强选择性的VRAC 抑制剂。

6.双香豆素阻断VRAC 通道可减轻CCI 引起的机械超敏反应

双香豆素在小胶质细胞中以剂量依赖的方式抑制了低渗透压诱导的VRAC 电流，其IC50(4.1 μM)与HEK293T 细胞相似，可有效阻断S1P 诱导的VRAC电流和小胶质细胞中ATP 的释放。双香豆素显著抑制了CCI 诱导的脊髓背角II 层神经元sEPSC 的幅度和频率增加。在雄性小鼠鞘内注射双香豆素短暂缓解了CCI 诱导的机械性触诱发痛，表明其潜在的临床应用价值。

三、讨论

尽管各种细胞类型的渗透性肿胀导致依赖VRAC 的细胞外ATP 浓度增加，但缺乏VRAC 是ATP 渗透通道的直接证据，并且VRAC 介导的ATP释放在生理和疾病状况中的功能意义尚不清楚。该研究提供了SWELL1 介导VRAC 直接传导和释放ATP 的电生理学证据。功能上，小胶质细胞SWELL1 通道参与神经损伤诱导的脊髓细胞外ATP含量的增加，激活脊髓小胶质细胞，并诱发背角神经元过度兴奋和神经病理性疼痛样行为。由FDA批准的药物—双香豆素可作为新型有效的VRAC抑制剂，通过鞘内给药可减轻CCI 后小鼠机械性触诱发痛，为用双香豆素治疗神经病理性疼痛提供了可靠的理论依据。

除了脊髓中的小胶质细胞，该研究中使用的Cx3cr1-Cre品系小鼠也会使脑中的小胶质细胞和外周巨噬细胞中Cre 依赖的基因缺失，这两种细胞也与神经病理性疼痛有关。虽然不能排除这些细胞中VRAC 缺失对Swell1cKO 表型的可能贡献，但该研究的药理学数据证明，双香豆素处理脊髓薄片后抑制了CCI 诱导的脊髓背角神经元突触传递增强，鞘内给予双香豆素缓解了CCI 诱导的机械超敏反应，表明脊髓小胶质细胞中的SWELL1 通道对神经病理性疼痛的发病机制至关重要。

脊髓小胶质细胞中的VRAC 如何调节神经病理性疼痛呢？由于小胶质细胞对周围神经损伤反应迅速，推测小胶质细胞中的SWELL1 通道被包括S1P在内的各种炎症信号选择性激活，SWELL1 介导的ATP 释放进一步激活小胶质和神经元的P2X 和P2Y受体。这种自分泌-旁分泌嘌呤能信号驱动小胶质细胞激活，引起神经活性因子（如IL-1β）的分泌和背角神经元的异常活动。未来的研究应使用基因表达谱和活细胞成像来揭示SWELL1 通道介导的小胶质细胞激活的详细机制。值得注意的是，最近的一项研究使用了类似的cKO 小鼠模型，报道了缺血性脑卒中损伤后，Swell1的丢失并不影响中枢小胶质细胞的形态学变化。有研究表明SWELL1 对于脑局灶性激光损伤后的小胶质细胞迁移和趋化过程是非必要的。因此，SWELL1 对小胶质细胞激活的调节可能取决于损伤类型、位置和特定的病理生理背景。

鉴于嘌呤能信号在疼痛中的重要性，其他几种ATP 释放机制也可能与神经病理性疼痛有关。遗传学和药理学研究均表明，另外两个大孔通道连接蛋白-43 (connexin-43) 和泛连接蛋白-1 (pannexin-1)促进神经病理性疼痛产生，尽管尚不确定它们是否调节脊髓细胞外ATP 浓度。脊髓背角神经元中胞外分泌的含有ATP 的囊泡对神经损伤后细胞外ATP 含量增加和疼痛超敏反应至关重要，这种机制似乎不涉及小胶质细胞的激活，因为缺乏囊泡核苷酸转运蛋白的小鼠表现出与WT 对照组相似的形态变化和脊髓小胶质细胞的增殖。也有报道称，Cx3cr1-Cre品系小鼠可能使神经元中靶基因缺失，尽管部分原因可能是由于报告基因泄漏导致的。然而，该研究并不能排除神经元中的SWELL1 通道也参与ATP释放和疼痛超敏反应的可能性。未来的工作需要揭示不同的ATP 释放机制和细胞类型如何共同调节脊髓细胞外ATP 水平，从而诱导神经病理性疼痛。

VRAC 是一种普遍表达的离子通道，其电流也存在于其他胶质细胞，包括星形胶质细胞。然而，单独敲除小胶质细胞中的Swell1和消除VRAC 活性可显著减少CCI 诱导的雄性小鼠神经病理性疼痛样行为，这突出了小胶质细胞和神经元-小胶质细胞相互作用在神经病理性疼痛中的重要性。值得注意的是，中枢星形胶质细胞中的SWELL1 通道介导谷氨酸释放，通过兴奋毒性加重缺血性脑损伤。因此，双香豆素治疗对机械痛敏反应的缓解可能不是通过单独抑制小胶质细胞VRAC 和嘌呤能信号来发挥作用的。未来的研究还应包括选择性地敲除脊髓星形胶质细胞中的Swell1，来揭示神经元-星形胶质细胞相互作用和谷氨酸在神经病理性疼痛的发生和维持中的作用。

目前可用的大多数VRAC 抑制剂效力低，选择性差。虽然DCPIB 是一种相对有效且广泛使用的VRAC 抑制剂，但它对细胞具有非特异性和毒性，可抑制或激活六种其他离子通道和转运体。该研究发现双香豆素和安可米是有效的选择性的VRAC阻滞剂，为探索SWELL1 通道的功能及评估其治疗潜力提供了急需的药理学工具。双香豆素可达到的血浆水平显著高于其抑制VRAC 活性的IC50值，这为将双香豆素用作治疗神经病理性疼痛的新方法创造了广阔的治疗窗口。该研究表明，鞘内给药双香豆素可缓解CCI 引起的机械性触诱发痛。未来的工作将使用不同的药物治疗方案、检测更多指标（如自发性和持续性疼痛）和更多的疼痛模型，进一步确定药物的镇痛情况。这将为更好地靶向Swell1治疗神经病理性疼痛和其他与VRAC 活动异常相关的疾病（如缺血性中风）提供可靠的实验依据。