“慢性应激—免疫微环境重塑”视角下的乳腺癌肝郁证治解读

刘磊,李冰冰综述 林家茂审校

2020年乳腺癌全球新发226万,我国新发42万,均居女性恶性肿瘤之首[1]。乳腺癌属于中医“乳岩”“乳石痈”等范畴,肝气郁结贯穿乳腺癌发生发展的整个病程,肝郁是乳腺癌的病变基础、核心病机[2-3]。近年来,现代医学逐渐认识到慢性应激在乳腺癌发病、进展、转移和治疗中的重要性,“慢性应激—免疫微环境重塑”已成为近年肿瘤研究的热点。本文试从“慢性应激—免疫微环境重塑”角度解读乳腺癌病机、探索中医疏肝方药的作用机制,为乳腺癌的中西医结合研究提供有益参考。

1 “慢性应激”导致肝郁引发乳腺癌

乳腺癌中医肝郁病机与现代医学“慢性应激”有关。慢性应激是由手术、环境和心理社会等一系列应激因素引起的机体长期过度的神经递质及激素的释放,主要包括下丘脑—垂体—肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)与交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)。慢性应激与恶性肿瘤发生、进展的关系近20年才逐渐被揭示。越来越多的证据表明,不良生活事件刺激、长期焦虑情绪等慢性应激显著增加乳腺癌患病风险并促进疾病恶化。研究发现,“慢性应激”机体长期处于失稳状态,会产生抑郁、不安和焦虑负面情绪等,增加肿瘤发生的风险[4]。流行病学和循证医学数据表明慢性心理应激是乳腺癌发展和转移的危险因素,长期处于慢性应激状态的乳腺癌患者预后更差[5-6]。与血清肾上腺素水平低的乳腺癌患者相比,肾上腺素水平高的患者总生存率和无病生存率显著降低;并且与邻近的非癌组织相比,具有高水平激素的女性在活检乳腺癌组织中也具有高水平的乳酸脱氢酶[7]。

“慢性应激”与肝郁有着本然一致性。中医认为,肝主疏泄,调畅情志,情志病因的实质是不良生活事件所形成的心理应激,情志反应太过或不及,超越了人体生理、心理的适应与调节能力,就会损伤脏腑精气,导致气血失调,临床上常将反复长期的精神刺激归属于“肝郁证”范畴[8]。应用慢性不可预见性应激方法模拟中医肝气郁滞动物模型已经得到学术界的广泛认可[9]。情志失调与乳腺癌的发生发展甚至转移,复发及生存期缩短存在密切关联[10]。“忧怒抑郁,昕夕积累”是乳腺癌重要病因,“肝郁”是乳腺癌发病的首要病机。慢性心理应激促进乳腺癌的发生发展,与中医理论认为乳腺癌为“七情致伤之症”不谋而合[11]。慢性应激可诱发肿瘤发生并促进肿瘤演进,特别是对机体的免疫功能和肿瘤微环境的重塑具有重要影响[12]。因此,慢性应激是抑郁、焦虑等情志因素与乳腺癌之间的一个重要中介因素,与乳腺癌的发病、预后密切相关,中医乳腺癌肝气郁滞的病机实质或与慢性应激引起的肿瘤微环境变化有关[13]。

2 “慢性应激—免疫微环境重塑”是乳腺癌发生、发展的重要机制

慢性应激可导致交感神经元和肾上腺髓质、皮质释放儿茶酚胺、糖皮质激素,主要包括去甲肾上腺素、肾上腺素、皮质醇等。乳腺癌肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment,TIME),是指浸润到乳腺癌内部的免疫细胞及其所分泌的细胞因子与肿瘤细胞共同构成的局部内环境,是一个双向、动态、错综复杂的相互作用网络[14]。TIME与肿瘤免疫逃逸、血管生成、侵袭转移及局部耐药等显著相关,对乳腺癌预后及疗效影响巨大。肿瘤浸润的免疫细胞主要包括巨噬细胞、髓源抑制性细胞、自然杀伤细胞( natural killer cell,NK细胞)、T细胞、B细胞及树突细胞(dendritic cells, DCs)等。多项研究表明TIME中淋巴细胞及髓系细胞上均有应答应激相关激素的受体[15-16]。应激激素大量分泌可通过抑制机体免疫反应、重塑肿瘤免疫微环境,促进乳腺癌的发生、发展[17]。

2.1 慢性应激调节巨噬细胞重塑TIME 巨噬细胞通常极化为两种类型:经典活化的M1型巨噬细胞和替代性活化的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要功能是激活Th1免疫应答,介导炎性反应及通过吞噬作用杀死肿瘤细胞[18];M2型巨噬细胞可产生IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子抑制抗肿瘤免疫反应,分泌金属蛋白酶诱导组织重塑,通过VEGF促进血管生成,促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),在肿瘤的血管重构、增殖、侵袭、免疫逃逸等方面起着重要的作用[19]。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)与肿瘤患者预后呈负相关,在肿瘤生长过程中,TAMs被强制表露出M2型巨噬细胞的特点。研究证实,M1型和M2型巨噬细胞都具有高度的可塑性,维持巨噬细胞的M1样表型及促进M2向M1转化是改善TIME重塑的研究方向之一[20]。

抑郁症状与巨噬细胞浸润到肿瘤微环境中呈正相关[21]。Bower等[22]通过全基因转录组法分析发现,社会孤立的早期乳腺癌的肿瘤标本中EMT和M2型巨噬细胞的基因表达上调,从而加速乳腺癌的侵袭和转移。体外实验表明[23],去甲肾上腺素及肾上腺素通过激活β2肾上腺素受体促进巨噬细胞向M2型转化。Chen等[24]通过构建慢性应激诱导的乳腺癌肺转移小鼠模型,发现β肾上腺素能信号持续激活可导致肺组织中巨噬细胞浸润、并上调单核/巨噬细胞表达CCR2,从而促进乳腺癌细胞的肺定植转移。Wu等[25]通过构建拘束应激/应激激素皮质酮负荷的小鼠荷瘤模型,发现皮质酮可通过调节LRP1/SIRPα的表达平衡抑制巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的作用,并证实miRNA-4695-3p可能是调控LRP1/ SIRPα表达的潜在靶点。

2.2 慢性应激增加骨髓来源抑制细胞重塑TIME 骨髓来源抑制细胞 (myeloid-derived suppressor cells, DSCs) 起源于骨髓祖细胞和未成熟髓细胞,主要分为粒细胞/多形核细胞MDSCs(PMN-MDSCs)和单核细胞MDSCs(M-MDSCs)两大细胞亚群,在乳腺癌原发性和转移灶中均大量存在[26]。MDSCs增殖的原因主要是肿瘤导致的 IL-1β、IL-6、TNF- α和S100蛋白等慢性炎性因子的大量释放[27]。研究证实,DSCs 主要发挥免疫抑制功能,可以抑制由T细胞、B细胞和NK细胞介导的免疫应答,还能加强乳腺癌细胞侵袭与迁移能力、影响EMT、诱导转移前微环境形成[24,28]。

慢性应激预暴露可导致荷瘤小鼠中MDSCs升高,促进乳腺癌转移。MDSCs过继转移可显著增加肺转移灶。相反,用Gr-1抗体消耗内源性MDSCs可减轻肺转移。慢性应激可使血清去甲肾上腺素浓度和骨髓酪氨酸羟化酶表达显著升高。此外,β-肾上腺素能信号通路抑制剂普萘洛尔可抑制乳腺癌转移,防止慢性应激诱导的MDSCs的扩张[29]。还有研究发现,小鼠慢性应激可上调IL-6和JAK/STAT3信号通路的表达,而通过普萘洛尔阻断IL-6信号或抑制JAK/STAT3信号通路的激活可通过减少体内MDSCs的积累来减少肿瘤的生长和转移。此外,普萘洛尔抑制异丙肾上腺素诱导的4T1细胞上清液中IL-6的表达,降低体外诱导的MDSCs比例[30]。

2.3 慢性应激作用肿瘤浸润性T细胞重塑TIME 肿瘤浸润性T细胞主要包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+辅助性T淋巴细胞,后者已经确定包括Th1、Th2、Th17和Tregs细胞4个细胞亚群,Th1/Th2和Th17 /Treg两个稳态平衡在乳腺癌肿瘤免疫微环境中发挥关键作用[31]。目前研究显示慢性应激对乳腺癌肿瘤浸润性T细胞主要体现在CD8+细胞毒性T淋巴细胞、Th1/Th2失衡方面。

肿瘤免疫应答中,CD8+细胞毒性T淋巴细胞是抗肿瘤免疫的关键效应细胞;研究证实,存在CD8+T细胞浸润的乳腺癌术后患者无病生存时间(DFS)及总生存时间(OS)更长[21]。慢性应激促进皮质醇分泌,血清高皮质醇水平与乳腺癌术后患者复发风险成正相关[32]。皮质醇与糖皮质激素受体(GR) 结合发挥免疫抑制作用,Gandhi等[33]使用单细胞测序数据集来分析免疫细胞和肿瘤细胞之间的GR表达差异,结果显示免疫细胞上GR的表达高于肿瘤细胞和基质细胞,GR与 CD8+T细胞绝对分数呈正相关,GR的表达与B细胞、树突状细胞、CD4+T细胞和中性粒细胞之间的相关性较弱,高GR患者中T细胞衰竭基因PD-1、PD-L1、CTLA-4等表达亦显著升高。

CD4+辅助性T淋巴细胞中Th1亚群可活化、促进CD8+T细胞及NK细胞免疫效应;Th2亚群主要促进B细胞成熟,活化体液免疫应答[32]。研究显示,乳腺癌肿瘤组织中Th1/Th2比值小者预后更差,主要原因是Th1浸润少于Th2浸润,细胞免疫受抑制所致[35]。研究显示,心理应激可选择性抑制Th1细胞,促进Th1向Th2漂移,造成Th1和Th2细胞因子失衡,从而抑制细胞毒性T细胞介导的细胞免疫,削弱免疫监视,促进乳腺癌多的发生、发展[36]。还有研究发现,皮质醇能抑制Th1细胞介导的细胞免疫反应的释放,导致机体肿瘤防御破坏[37]。

2.4 慢性应激抑制NK细胞免疫监视重塑TIME NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞,其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境,主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞能非特异性杀伤肿瘤细胞,在肿瘤微环境中具有免疫监视的作用。

研究发现抑郁与NK细胞功能之间存在强烈的负相关性,患有严重心理应激的乳腺癌患者的NK细胞毒性减低,导致乳腺肿瘤细胞免疫逃逸,具体机制与杀伤免疫球蛋白样受体CD158b的表达改变有关[38]。慢性应激状态下NK细胞对肿瘤的免疫监视作用可被糖皮质激素减弱,进而引发乳腺癌[39]。乳腺癌患者中,高水平的压力与通过IFN-γ 刺激的低NK细胞毒性和低NK细胞反应相关,在乳腺癌应激动物模型的血样中也观察到类似的NK细胞毒性功能受损[40]。此外,慢性应激介导的血清素、多巴胺、儿茶酚胺等的改变均可抑制NK活性,从而影响机体正常保护性免疫[41]。

2.5 慢性应激影响B细胞重塑TIME 以往对恶性肿瘤相关的免疫性因子的探寻多集中在T细胞研究上,但近些年的研究提示B细胞对恶性肿瘤的预后、疗效也至关重要。B细胞起源于骨髓,然后迁移至脾脏、淋巴结等次级淋巴结构,与抗原相互作用并产生抗原特异性抗体。

研究显示,B细胞产生特异性抗体的能力可能会受到慢性应激诱导的Th1/Th2失衡的影响,且精神压力刺激也会影响B细胞的再分配及其存活[14]。与CD20+B细胞浸润程度较低的三阴性乳腺癌患者相比,CD20+B细胞在浸润程度较高的患者中肿瘤核心、边缘及间质均分布较多,且预后较好[42]。乳腺癌患者儿童时期不良事件经历与肿瘤B细胞浸润增加显著相关[21]。

2.6 慢性应激抑制树突状细胞重塑TIME 树突状细胞(DCs)是功能最强的专职抗原呈递细胞,DCs能够特异性刺激B/T细胞成熟,激活适应性免疫应答,是启动与维持对恶性肿瘤细胞免疫反应的基础[43]。DCs 分为未成熟态和成熟态,未成熟DCs主要发挥免疫监视功能,具有极强的抗原吞噬能力。成熟DCs功能完善,表达高水平的共刺激因子和粘附因子,经由MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ类途径将肿瘤抗原转运至引流淋巴结内,激活细胞毒性 T 淋巴细胞。另外,DCs能促进Th细胞、NK细胞活化,产生抗肿瘤免疫反应[44]。

研究发现,慢性应激可通过阻碍DCs成熟抑制Th1细胞和CD8+T细胞。慢性应激促进糖皮质激素升高,诱导免疫抑制转录调节因子TSC22D3表达,从而抑制DCs活性[45]。糖皮质激素抑制DCs活化和迁移,促进DCs凋亡,并诱导耐受性DCs表型的产生;耐受性DCs主要通过抑制效应T细胞及诱导Tregs发挥免疫耐受作用。还有研究表明慢性应激通过β2-肾上腺素能受体调节IL-10和IL-13产生抑制DCs迁移[46]。

3 疏肝解郁方药调节“慢性应激—免疫微环境重塑”改善乳腺癌预后

乳腺癌的发生、发展是一个复杂的生物学过程,肝郁是其基本病机,疏肝解郁是其对应的基本法则[47]。中医治疗乳腺癌方剂整体以疏肝解郁为主,临床常用的疏肝解郁经典方剂主要有四逆散、柴胡疏肝散、逍遥散等,疏肝方药对抗乳腺癌慢性应激疗效确切。研究发现[48],慢性心理应激显著促进了小鼠乳腺癌生长转移,四逆散不仅可以减轻小鼠的抑郁样行为,而且还能抑制慢性心理应激诱导的乳腺肿瘤生长和肺转移,显著降低乳腺癌细胞有氧糖酵解蛋白c-Myc、LDHA、PDK1的表达。另一项研究也表明[49],四逆散可以显著抑制慢性心理应激诱导的小鼠乳腺癌异种移植瘤生长和转移,荧光素酶报告基因分析筛选出柚皮素是四逆散中触发肝细胞雌激素硫转移酶活性的最具生物活性的化合物。慢性束缚应激法复制的肝郁证模型大鼠的乳腺出现增生样变且伴有癌前相关因子的异常表达,柴胡疏肝散对模型大鼠肝郁证相关指标有较好的改善作用,还可缓减其乳腺增生及调节促癌/抑癌因子的表达[50]。慢性应激损伤能刺激大鼠血清肿瘤标志物升高,有直接诱发肿瘤发生的可能性。逍遥散能够有效降低慢性应激诱发的肿瘤标志物升高,有望预防慢性应激诱发的癌变[51]。

疏肝理气法在肿瘤免疫编辑重塑过程中也起着重要作用,疏肝解郁方药可通过调节T细胞相关细胞因子以调整免疫功能,从而发挥免疫监视;还能够激活单核巨噬细胞及NK细胞活性,调节MDSC[52]。游紫萱等[53]研究发现逍遥蒌贝散可调节乳腺癌根治术后辅助化疗患者的血液T淋巴细胞亚群水平以增强免疫功能,抑制术后引流液IL-8、TNF-α含量,以减轻炎性反应,利于患者康复。常彦祥等[54]研究发现疏肝解郁之要药柴胡的有效成分柴胡皂苷D可调节大鼠外周血T淋巴细胞亚群水平,提高细胞免疫功能,有助于改善机体抗肿瘤能力。杜家豪等[55]研究发现小柴胡汤可通过促进淋巴细胞的转化,诱发细胞进一步分泌干扰素,提高CD3+、CD4+、IgG、IgA、IgM水平,抑制CD8+表达,提高机体细胞免疫及体液免疫的能力,发挥抗癌效应。Lu等[56]通过接种乳腺癌细胞诱导乳腺癌模型,慢性应激刺激诱导抑郁模型,两者结合建立抑郁癌模型,探讨疏肝健脾方预防乳腺癌发展的机制。结果表明抑郁障碍和肿瘤生长可不同程度地抑制小鼠的免疫功能,疏肝健脾方可通过降低CD8+调节免疫微环境T淋巴细胞凋亡和肿瘤细胞活性,增强免疫监视能力,抑制MDSC增殖,从而延长乳腺癌荷瘤小鼠的生存时间。

综上,疏肝解郁方药可通过干预“慢性应激—免疫微环境重塑”改善乳腺癌预后,其具体作用机制将是中西医结合研究乳腺癌的重要内容。