拟南芥叶片衰老前后叶绿素降解代谢基因表达和酶积累的模式及其影响因素分析

窦锦慧,陈俊毅,鲁 凡,吴声栋,蒯本科,张鼎宇

(1.复旦大学 遗传工程国家重点实验室,上海 200438;2.复旦大学 生命科学学院,上海 200438)

作为特化的光合器官,叶片的生长发育与衰老是植物生活史中的重要环节。叶片发育成熟后在内外因素的作用下逐步进入衰老窗口(senescence window),位于同一植株上的叶片发生递进式衰老,其中的核酸、脂质、蛋白质等大分子物质有序降解[1],降解产物被转运到新生组织/器官中加以重新利用,这是营固着生活的植物在长期演化过程中形成的生存策略,极大地提高了植物对外界环境变化的适应性。在多年生落叶植物中,衰老叶片中的营养主要贮藏于茎干中以便于来年的发芽/开花与生长/发育,植株随之表现出季节性的叶色变化;在一年生植物中,衰老叶片中的营养主要用于种子或根茎类贮藏器官的发育[2]。研究表明,高达95%的种子蛋白是由衰老叶片中蛋白降解产生的氨基酸合成的[3],表明叶片衰老是一个确保后代生存的关键生物学过程。在农业生产上,叶片过早或过晚衰老均可能导致作物减产,叶片快速衰老也会导致绿叶蔬菜的采后衰败和养分流失。因此,研究叶片衰老不仅有助于加深我们对植物发育生物学过程的理解,而且还能够为作物农艺性状的遗传改良和绿叶菜采后的贮藏保鲜提供机理依据和技术手段[2]。

叶片营养物质的动员与再利用首先发生于含氮量最为丰富的叶绿体中[4-5]。叶绿素的降解是叶绿体崩解过程中的早期事件,是叶片衰老最为明显的标志,更是叶绿素-结合蛋白复合体解离的前提条件[6]。叶绿素降解途径(PAO/phyllobilin途径)包括一系列酶促反应: 叶绿素b首先被还原为叶绿素a再被进一步降解,叶绿素a在叶绿体中经过脱镁、脱植基、开环和还原四步反应被降解为初级荧光代谢产物(pFCC);pFCC随后被转运出叶绿体并发生一系列侧链修饰反应,最后储存于液泡中[7-9]。值得强调的是,细胞中游离的叶绿素及其早期降解产物会产生光敏毒性,因此“非工作”状态的叶绿素需要被及时、充分地降解。叶绿素降解代谢酶基因(ChlCatabolicGenes,CCGs)精细有序的表达,以及叶绿素降解代谢酶(Chl Catabolic Enzymes,CCEs)活性的适度维持是叶绿素及时降解的前提和保障。

近年来,CCGs的转录调控机制已经得到了较为深入细致的研究[10-14]。研究表明,多种内源激素及外源环境因子协同调控CCGs的表达[15]。光是调控叶片衰老最为重要的外源环境因子。光信号广泛参与调控植物的种子萌发、形态建成和开花等发育过程,既是植物的能量来源,同时也蕴含着许多环境信息。拟南芥红光/远红光受体(phytochrome B,phyB)在光下以活性的Pfr形式进入细胞核,与bHLH 家族的转录因子(Phytochrome Interacting Factors,PIFs)互作,促使后者磷酸化并进一步被降解,植物因此得以快速响应外界的光环境变化[16]。PIFs可以响应并介导多种光信号应答,通过与多种基因启动子上的G-box(CACGTG)结合来调控其表达。研究表明,PIF4和PIF5在黑暗中积累后可以直接上调NYE1和NYC1等CCGs的表达,进而参与黑暗诱导的衰老与自然衰老过程中叶绿素的降解[17-18]。此外,昼夜节律对于植物体维持自身生理代谢过程至关重要[19]。研究表明,昼夜节律调控因子CCA1(CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1)可以通过抑制CCGs的上游调控因子ORE1(ORESARA)的表达进而抑制叶片衰老,其突变体cca1在长日照条件下显示出早衰表型[20]。ORE1是叶片衰老褪绿的核心调控因子,可以通过直接结合NYC1、NOL、NYE1和PAO等CCGs的启动子使其上调表达[10,12]。值得注意的是,现阶段关于CCGs表达调控的研究主要聚焦于进入衰老窗口的叶片中,对未衰老叶片中CCGs的表达及其对昼夜更替的响应模式研究还鲜有报道。本研究中,我们在对叶片自然衰老过程中CCGs/CCEs表达变化分析的基础上进一步探究了CCGs在长日照培养条件下的表达模式,相关研究结果提示了光信号对未衰老叶片中CCGs表达调控的关键作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

本研究以Columbia(Col-0)生态型拟南芥(Arabidopsisthaliana)作为野生型,突变体cca1-1(CS67781)来自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC)[20]。突变体nyc1之前由实验室从日本北海道大学Ayumi Tanaka博士处获得[21]。花无缺肥料(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶1)来自上海永通生态工程股份有限公司。大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)感受态菌株以及pET-28a质粒用于蛋白的原核表达。限制性内切酶、高保真DNA 聚合酶、DNA 连接酶购自TaKaRa生物有限公司,菌落PCR 所用Taq酶购自近岸蛋白(Novoprotein)。质粒抽提、PCR 产物纯化试剂盒购自Axygen公司。引物合成、质粒测序服务由金唯智公司完成。FLAG 抗体(鼠源)购自Abmart公司,相应二抗购自Bio-Rad 公司;NYC1抗体(兔源)由安驰生物定制。

1.2 实验方法

1.2.1 植物材料种植

本论文植物材料均在温室培养。培养条件为: 长日照(16h光照/8h黑暗)、光照强度100μmol·m-2·s-1、相对湿度70%、温度22℃。将灭过菌的营养土盛入塑料钵中,营养土配比为m蛭石∶m黑土∶m珍珠岩=9∶3∶0.5,将钵放在托盘上。在托盘中加入无菌水,待土壤吸足水后将种子均匀点在土壤表面并置于4℃环境中层积处理3～5d。点种后在托盘上覆盖透明盖,待3～4d种子萌发后揭开透明盖,间苗,并定期浇水,播种和植株开花时各浇花无缺培养液一次。

1.2.2 叶绿素含量检测

使用SPAD-502 PLUS(Konica Minolta)叶绿素仪测定叶片叶绿素含量。将仪器电源打开后空载检测,待仪器发出响声,屏幕显示N=0后表示完成调零。将样品完全覆盖接收窗,避开叶脉处。测量面积为2mm×3mm,厚度约1.2mm。每片叶由基部向尖部取不同位置测量3～4次,取平均值。

1.2.3 离子泄漏率检测

使用Thermo ScientificTM的EutechTMECTestr11+双量程电导率检测仪测定叶片离子泄漏率。取离体叶片并用ddH2O冲洗2～3遍,用滤纸吸干叶片表面水分。将叶片置于2mL离心管并加入2mL ddH2O,将离心管置于摇床低速摇1～2h。用ddH2O清洗检测仪传感器2～3遍后,吸取0.5～1mL离心管中液体加入样品槽,记录检测电导值为L1。将离心管置于100℃煮沸30min,冷却后吸取0.5～1mL离心管中液体加入样品槽,记录检测电导值为L2,L1/L2即为叶片离子泄漏率(Ion Leakage)。

1.2.4 拟南芥RNA 提取

取下植物叶片后迅速放入液氮保存,将研钵或振荡机用液氮预冷,研磨样品。使用TRIzol法提取叶片总RNA。

1.2.5 实时荧光定量PCR

使用产品SYBR®Premix Ex TaqTM(TaKaRa Code: DRR081A)进行RT-qPCR,并按照说明书进行实验操作。实验所用引物序列见表1。

表1 引物清单Tab.1 List of primers

1.2.6 反转录

使用试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(TaKaRa Code: RR036A)进行拟南芥总RNA 的反转录,并按照说明书进行实验操作。

1.2.7 融合蛋白表达载体的构建

以野生型拟南芥cDNA 为模板,设计引物PCR 扩增不含叶绿体信号肽(chloroplast Transit Peptide,cTP)的NYC1的CDS序列。将pET-28a载体与获得的目的PCR产物进行酶切、纯化并连接,转化大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)感受态细胞。挑阳性菌落进行菌落PCR验证并送测,提取质粒,获得pET-28a∷NYC1-His融合蛋白表达载体。

1.2.8 蛋白原核表达

选取菌落PCR 及测序验证序列无误的单菌落,转入含有相应抗生素的2mL LB中,37℃、220r/min摇床过夜。转移1mL培养的新鲜菌液至含有相应抗生素的LB 液体培养基中,37℃、220r/min条件下培养至OD600=0.4～1.0)。将菌液冰浴30～60min降温,吸取1mL 菌液作为未诱导的对照组,标记为“诱导前”,余下的菌液加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.4mmol/L,于16℃、220r/min摇床诱导外源蛋白的表达。诱导表达结束后,吸取1mL菌液标记为“诱导后”。加入上样缓冲液后进行SDS-PAGE检测,依次上样Marker、“诱导前”、“诱导后”,检测目的蛋白是否诱导表达成功。

1.2.9 拟南芥蛋白质提取

拟南芥叶片样品取下后立即放入液氮保存,液氮研磨后,按100mg∶300μL 的比例加入蛋白提取液[50mmol/L Tris-HCl,pH7.0,2%(质量分数)SDS,10%(体积比)glycerol]。4℃缓慢摇晃0.5～1h,以充分提取叶片总蛋白。4℃、13000r/min离心5min,取上清,重复2～3次以完全去除杂质,-80℃保存备用。

1.2.10 蛋白质免疫印迹(Western blot)

首先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品,再将凝胶上的蛋白通过电泳转移到PVDF膜上,使用封闭液将膜上的非特异性蛋白结合位点封闭后使用相应的检测抗体进行孵育,最后通过化学发光法进行蛋白条带显影。

2 结果与分析

2.1 NYC1多克隆抗体的制备及特异性检测分析

叶片衰老过程中叶绿素降解代谢酶主要包括NYC1、NYE1、PPH 和PAO。实验室前期已经制备/获得了拟南芥NYE1、PPH 和PAO 蛋白的自身抗体。NYC1是叶绿素b还原酶,催化Chlb还原为Chla,该反应是叶绿素进入PAO 降解途径的前提条件,是叶绿素降解的关键步骤之一。因此,我们首先构建了NYC1的原核表达载体(图1(a)),并委托生物公司制备了NYC1的多克隆抗体。获得抗体之后,我们对NYC1抗体的识别作用进行了检测。结果显示,新制备的NYC1抗体能够识别原核表达的去除了信号肽(delete Transit Peptide,dTP)的NYC1 融合His标签的蛋白(dTP-NYC1-His)和Col-0 叶片内源的NYC1全长蛋白,在nyc1突变体中未检测到NYC1抗体特异性识别的目的蛋白;作为对照,原核表达的dTP-NYC1-His融合蛋白能够被α-His抗性所识别(图1(b))。这些结果表明,本研究获得的NYC1抗体可以特异性识别原核表达及叶片内源的目的蛋白。

图1 NYC1抗体的有效性检测Fig.1 NYC1 antibody effectiveness assay

2.2 CCGs及其编码蛋白CCEs在叶片衰老进程中大量表达/积累

为了探究CCGs表达量和CCEs蛋白丰度变化与叶片发育时期的关系,我们对长日照条件下生长的3周龄、4周龄和5周龄野生型拟南芥叶片分别进行了生理和分子表型的测定。结果显示,随着叶龄增加叶片逐渐启动衰老,叶片离子泄漏率会逐渐升高,叶绿素含量逐渐降低(图2(a),(b)和(c))。

图2 CCEs和CCGs在自然衰老的叶片中的积累与表达Fig.2 Accumulation of CCEs and expression of CCGs in age-triggered senescent leaves

利用拟南芥内源抗体分别分析叶片中NYC1、NYE1、PPH 和PAO 蛋白含量的结果显示,随着叶片叶龄增长,NYC1、NYE1、PPH 及PAO等CCEs逐渐积累并启动叶片衰老黄化(图2(d)),作为对照,Rubisco大亚基RBCL(Ribulose Bisphosphate Carboxylase Large chain)的含量在衰老叶片中显著下降。有趣的是,PPH 在未衰老的叶片中也存在明显积累,这可能与PPH 的脱植基功能以及细胞中植醇的回收利用有关[22]。通过对数据库的转录组数据分析发现,编码这些酶蛋白的基因CCGs多数在叶片衰老后期剧烈上调表达,与蛋白的积累模式一致[23](图2(e));CCGs之间的表达模式亦存在明显差异,NYC1和NYE1在衰老后期剧烈上调,NOL、PPH和PAO上调表达的倍数相对较小,而RCCR则呈现先上调后下调的表达模式。综上,随着叶龄的增加,叶片会启动CCGs的表达并积累大量CCEs蛋白,以快速启动叶片的衰老黄化。

2.3 未衰老叶片中CCGs的表达量在一天内存在明显波动

光信号和节律周期均会影响叶片衰老进程[18,20]。为了探究未衰老叶片中CCGs的表达模式,以及光信号和节律对CCGs表达的影响,我们进一步检测了未衰老叶片,即3周龄野生型拟南芥第3、4片叶中的NYC1、NOL、NYE1、PPH、PAO和RCCR在长日照生长条件下的表达量变化。结果显示,这些CCGs在一天内表现出了相似的表达模式,其表达量随光照开启而上调表达,并在10:00～16:00之间的某一时间达到峰值,随后逐渐下降(图3,见第570页)。

图3 长日照光周期下CCGs表达量在24h内的波动变化Fig.3 Fluctuations in CCGs expression during 24 hours under long-day photoperiod

2.4 光信号和节律信号关键调控因子的表达呈现出随光照变化的波动

研究表明,PIF4和CCA1作为光信号和节律信号的关键调控因子,可以直接或间接调控CCGs的表达进而调控叶片衰老[18,20]。在其他外界生长条件不变的情况下,CCGs在长日照条件下的表达波动很可能是由PIF4和/或CCA1的调控引起的。因此,我们随后检测了PIF4和CCA1在长日照条件下的表达量变化。结果显示,PIF4的表达呈现出随光照改变而剧烈波动的表达模式: 6:30光照开启后PIF4的表达剧烈上调,在12:30左右达到峰值后逐渐下降(图4(a),见第570页)。CCA1的表达也会随光照条件的改变而波动,其表达量在9:00 左右达到峰值后迅速降低(图4(b),见 第570 页)。因此,PIF4 和CCA1作为CCGs的上游调控因子可能参与了未衰老叶片中CCGs表达波动的调控。

图4 长日照光周期下PIF4 和CCA1 表达量在24h内的波动变化Fig.4 Fluctuations in PIF4 and CCA1 expression during 24 hours under long-day photoperiod

2.5 持续黑暗条件下CCGs表达的波动幅度显著减弱

为了进一步探究CCGs在一天中的表达量波动是否与光信号有关,我们检测了长日照条件下生长至3周的拟南芥在24h持续黑暗处理下主要CCGs的表达量变化。结果显示,在24h持续性黑暗条件下,PIF4表达波动的趋势明显减弱;与PIF4类似,所有CCGs在持续的黑暗处理下都不再于原定的时间点(6:30)剧烈上调表达,除了NYC1还维持轻微的表达波动外,NOL、NYE1、PPH、PAO及RCCR几乎完全均丧失了在长日照日内的剧烈规律性波动(图5)。这些结果显示,CCGs在持续黑暗条件下会丧失光照-黑暗交替条件下基因表达的规律性波动,表明光信号是影响CCGs在一天内表达规律性波动的主要因素。

图5 24h黑暗条件下CCGs表达量的波动变化Fig.5 Fluctuations in CCGs expression during the 24-hour dark treatment

2.6 节律核心调控因子CCA1突变对CCGs表达波动无明显影响

为了进一步探究未衰老叶片中CCGs在一天中的表达量波动是否与节律有关,我们检测了拟南芥突变体cca1-1以及野生型拟南芥植株的CCGs在一个长日照光周期下的表达量变化。结果显示,NYC1、NOL、NYE1、PPH、PAO和RCCR在Col-0中表现出的表达随光照波动未受到生物钟蛋白CCA1突变的影响,这些CCGs均在6:30灯光开启后上调表达,并在10:00～16:00之间的某一时间达到峰值,随后逐渐下降(图6)。CCA1突变之后对CCGs的表达变化趋势和变化倍数并未造成明显影响,提示在非衰老叶片中CCA1介导的生物钟信号对CCGs表达波动的影响较小,进一步间接证明了光信号对CCGs表达调控的重要作用。

图6 长日照光周期下cca1-1 和Col-0中CCGs表达量在24h内的波动变化Fig.6 Fluctuations in CCGs expression in cca1-1 and Col-0 during 24 hours under long-day photoperiod

3 讨论

CCGs是叶片衰老褪绿的核心功能基因,在自然衰老、黑暗以及激素诱导的衰老过程中均会上调表达[8,18,24]。在衰老叶片中,CCEs的大量积累一方面与其编码基因CCGs的表达量在叶片衰老后期上升有关;另一方面,可能与其在叶片衰老后期存在维持蛋白及功能稳定的特殊机制有关,这提示CCEs的积累对进入衰老窗口的叶片快速启动衰老至关重要(图2)。

在叶片衰老后期,CCGs受到各种内/外源因素调控而上调表达,以完成衰老过程中的叶绿素有序降解[8]。然而,未进入衰老窗口的幼嫩植株/叶片中CCGs是否有表达及其表达模式的研究尚未见报道。在本研究中我们发现,未衰老叶片中的CCGs在一天中表现出较为一致的波动变化(图3)。我们之前的研究表明,黑暗诱导叶片衰老并通过PIF4正调控CCGs的表达启动叶绿素降解[18]。然而,在幼嫩的活体拟南芥叶片中CCGs的表达则在光照开启阶段呈现出上调表达的趋势(图3),这种不一样的表达模式可能与CCGs受到多个维度的调控因素有关: 在营养生长阶段,幼嫩叶片中叶绿素的合成代谢非常活跃,在外界环境黑暗-光照切换过程中可能会因叶片中游离的叶绿素而产生光损伤,因此通过启动某种信号(如ROS等)诱导CCGs的表达[15],CCGs较高的表达量反过来也提示CCEs可能在未衰老叶片中白天发挥清除游离叶绿素以解除光毒性的功能;尽管PIFs蛋白在光下不稳定,易被降解[25],但是在活体的未衰老叶片中,黑暗-光照切换所引起的PIF4转录剧烈上调表达仍可能导致部分PIF4蛋白直接或间接诱导CCGs的表达(图4)。有趣的是,CCGs表达达到峰值时间点存在一定的差异性(图3),这可能与CCGs启动子间的活性差异有关,实际上不同CCGs启动子上的顺势作用元件具有显著的差异性。

叶片进入衰老窗口后PIF4在黑暗诱导的叶片衰老过程中起关键性作用,PIF4突变显著影响黑暗诱导的CCGs的表达[18]。另一个有趣的现象是,在未进入衰老窗口的幼嫩叶片中,24h黑暗处理未能明显诱导CCGs的表达上调(图5),这提示黑暗通过PIF4诱导CCGs的表达明显具有叶龄依赖性,即黑暗更容易诱导进入衰老窗口叶片中CCGs的表达。尽管如此,外界光环境转换导致的CCGs表达波动在24h的持续性黑暗条件下明显被抑制,仍然重点提示了光照变化是幼嫩叶片是CCGs表达波动的关键作用因素之一(图3和图5)。

在恒温、恒湿、营养/水分充足的条件下,植物基因表达很可能受到外界光信号以及内源节律信号的影响。研究表明,昼夜节律对于植物协调各种生理和代谢过程至关重要[19]。CCA1是控制拟南芥昼夜节律的核心组分之一,其蛋白缺失突变体cca1丧失了原有的节律性[26]。之前的研究表明,CCA1对CCGs存在间接的负调控作用,且cca1相比于野生型在长日照条件下显示早衰表型,说明节律信号可以负调控叶片衰老[20]。我们的实验结果表明,CCA1突变不会明显影响未衰老叶片中CCGs的表达模式,表明CCA1不是未衰老叶片中CCGs表达量波动的主要调控因子,CCA1参与调控CCGs表达及叶片衰老可能存在时间或发育阶段的特异性(图6)。此外,PIF4的转录同样受到生物钟的调控[27]。在我们的研究中发现,24h黑暗处理明显减弱了光照变化引起的PIF4剧烈上调表达,但PIF4仍在原有时间节点维持相较微弱的上调表达,这可能就是由生物钟信号所调控的(图4(a)和图5(g))。

值得注意的是,植物在正常光照-黑暗交替的生长条件下,短时间光环境变化诱导的CCGs上调表达并不会启动叶片的衰老,特别是对于未进入衰老窗口的幼嫩植株/叶片。这可能与这些CCGs及其编码的CCEs蛋白的稳定性有关,即瞬时上调表达的CCGs和积累的CCEs蛋白相较少,不足以启动叶片衰老,随即因为光环境的变化又被迅速降解。而随着植物叶片发育进入到衰老窗口期之后,衰老相关调控激素的积累、CCGs基因染色质区域的表观修饰等,协同光信号通路共同调控CCGs适时、足量的表达,最终导致植物叶片进入不可逆的衰老进程[6,8]。