感冒止咳颗粒中柴胡的质量分析研究

周鹤，章顺

九江市检验检测认证中心，江西 九江 332000

感冒止咳颗粒是由柴胡、黄芩、桔梗、青蒿、连翘、葛根、山银花、苦杏仁、薄荷脑等九味中药组成，可用于治疗因外感风热引起的咳嗽症状［1］。方中柴胡、山银花疏散退热，共同为君药；葛根具有解肌退热的功效，青蒿可缓解虚热，而连翘和黄芩则可清热解毒，共为臣药；桔梗与苦杏仁共同发挥宣降肺气、止咳化痰的功效，而薄荷脑芳香辛散则作为辅助药物，与其他药物协同作用，起到清热解表、止咳化痰的效果。感冒止咳颗粒具有疏风宣肺，清里透表之功效，临床上主要治疗风寒表证引起的咳喘及小儿发热恶寒等症［2］。目前，感冒止咳颗粒的法定标准为《中国药典》2020 年版一部，标准只规定了黄芩苷的含量测定项目。查阅相关文献［3-6］，未有感冒止咳颗粒中君药柴胡的含量测定方法研究。本研究建立了感冒止咳颗粒中柴胡的薄层色谱法和柴胡皂苷a 的高效液相色谱法，对13 个企业生产的45 批感冒止咳颗粒进行了柴胡的定性和定量分析，以便更全面地反映感冒止咳颗粒的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695 HPLC 色谱仪（waters 公司）；Jp080s 型超声机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；薄层色谱数码成像系统（Camag 公司）；AGF285 型电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）。

1.2 对照品

柴胡皂苷a 对照品（批号：110777-201912，含量94.8%）；柴胡皂苷d 对照品（批号：110778-201912，含量96.3%）；柴胡对照药材（批号：120992-201509）；均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 样品

共有13 个企业的45 批次感冒止咳颗粒样品，其中生产企业A 8 批，生产企业B 9 批，生产企业C 5 批，生产企业D 4 批，生产企业E、F 各3 批，生产企业G、H、I、J、K、L 各2 批，生产企业M1 批。按感冒止咳颗粒处方制备缺柴胡阴性对照样品。

1.4 试剂

硅胶G 薄层色谱板（德国默克公司，批号：HX90656226）；超纯水；乙腈、磷酸为色谱纯；对二甲氨基苯甲醛（麦克林，批号C11854367）；乙酸乙酯、乙醇、甲醇、正丁醇、氨水、硫酸均为分析纯。

2 柴胡薄层色谱鉴别

取样品20 g，研细，加甲醇50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL 使溶解，加正丁醇振摇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2 次，每次20 mL，弃去氨洗液，再用正丁醇饱和的水洗涤2 次，每次30 mL，弃去水洗液，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取柴胡对照药材约1.0 g，加甲醇25 mL，同法制成对照药材溶液。取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 对照品适量，加甲醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。取缺柴胡阴性对照样品，同法制备阴性对照溶液。吸取上述五种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液［1］，60 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视［7-8］。

薄层色谱结果表明：供试品色谱中在与柴胡皂苷a 对照品和柴胡对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与柴胡皂苷d 对照品色谱相应的位置上，未显相同颜色的斑点；阴性对照溶液无干扰。

3 柴胡皂苷的液相鉴别

3.1 色谱条件

Waters e2695-2424 型 HPLC 色谱-ELSD 检测器；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（81∶19）；流速0.7 mL/min；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；进样量10 μL。ELSD 检测器检测参数：载气（N2）体积流量2.38 SLPM/min，漂移管温度90 ℃。

3.2 溶液配制

3.2.1 对照品溶液的制备称取柴胡皂苷a 对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成含柴胡皂苷a0.387 7mg/mL 的溶液。

3.2.2 供试品溶液的制备取样品约20 g，研细，精密称定，加甲醇50 mL 超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，加正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2 次，每次20 mL，弃去氨洗液，再用正丁醇饱和的水洗涤2 次，每次30 mL，弃去水洗液，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至2 mL 量瓶，作为供试品溶液。

3.2.3 阴性对照溶液的制备称取缺柴胡阴性对照样品约20 g，同“3.2.2”项下方法制备，即得。

3.3 系统适应性试验和方法学考察

3.3.1 系统适应性试验取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液，按“3.1”项下色谱条件进行分析，结果见图1。

图1 感冒止咳颗粒HPLC色谱图：A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液

3.3.2 线性关系考察精密吸取对照品溶液10 µL和30 µL，注入液相色谱仪测定峰面积。以进样质量（µg）的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标，绘制log-log 标准曲线并进行回归分析。结果表明：柴胡皂苷a 在3.877～11.63 µg 范围内，峰面积与进样质量呈良好的log-log 线性关系，回归方程y=1.003 936x+5.258 356，相关系数r=0.999 9。

3.3.3 精密度试验精密吸取对照品溶液10 µL，按“3.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，结果柴胡皂苷a 峰面积的RSD 为0.5%，表明仪器精密度良好。

3.3.4 重现性试验取样品（批号：ZCB2106）6 份，各约20 g，按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件测定，结果柴胡皂苷a 平均含量为0.052 5 mg/g，RSD 为0.8%。

3.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、24 h 进样测定，结果供试品溶液中柴胡皂苷a 峰面积RSD 为0.3%，表明供试品溶液24 h 内稳定。

3.3.6 回收率试验采用加样回收试验，取已知含量的样品（批号：ZCB2106）6 份，各约10 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.035 7 mg/mL 的柴胡皂苷a 对照品溶液15 mL，按“3.2.2”项下方法分别制备6 份回收率供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为96.8%，说明方法准确度较高。结果见表1。

表1 柴胡皂苷a回收率试验结果

3.3.7 检测限考察取对照品溶液用甲醇进行逐级稀释并进样分析，当信噪比（S/N）为3 时，柴胡皂苷a 的检出限为0.007 mg/mL。

3.4 样品测定

45 批样品按上述方法进行柴胡皂苷a 的测定，计算样品中柴胡皂苷a 含量。结果见表2。

表2 各企业样品中柴胡皂苷a的含量测定结果 mg/g

4 讨论

由于柴胡皂苷a、d 分子中环氧结构的不稳定性，导致在生产工艺水煎煮过程中大量转化成柴胡皂苷b1和b2。在本研究中，样品的制备过程在碱性条件下提取，尽量减少柴胡皂苷a、d 的转化。但试验结果为柴胡皂苷d 均未检出，柴胡皂苷a 部分被转化，导致两种皂苷含量的不确定性［9-10］，这也是目前众多柴胡制剂标准未对柴胡皂苷控制的主要原因。

本研究针对13 个企业的45 批次样品进行柴胡、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的薄层鉴别，结果所有批次样品中均未检出柴胡皂苷d，原因可能是在柴胡饮片煎煮加工过程中，柴胡皂苷d 易出现水解的现象，使得柴胡皂苷d 无法检出。柴胡皂苷a 薄层色谱检测结果与HPLC 检测结果一致，说明所建立的薄层色谱具有较高的准确度，可以用于识别感冒止咳颗粒中的柴胡皂苷a。

根据表2 结果，共有16 个批次样品未检出柴胡皂苷a，检出柴胡皂苷a 的样品含量在0.007 3～0.052 5 mg/g 之间，最高含量和最低含量之间相差7.2倍。不同企业或同一企业不同批次样品中柴胡皂苷a 含量差异较大，可能与药材产地、采收季节、生产工艺等因素有关。其中企业B 生产的9 个批次样品中均未检出柴胡皂苷a，具体原因有待进一步研究，提示相关企业及监管部门应引起重视。