渴肾方对糖尿病肾病大鼠肾小管间质损伤的影响

冯晓轩，王琛

上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学中医肾病研究所，上海市中医临床重点实验室，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海 201203

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖代谢异常引起的肾小球硬化症，属微血管病变，是终末期肾病的主要原因之一[1]。DN 全球发病率逐年升高，患病人数超过3.5亿[2]，但目前发病机制仍不明确，且尚无有效治疗手段。DN主要与肾血流动力学改变、氧化应激、炎症、缺氧和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）过度激活有关[3]。对于DN肾损伤的研究主要集中于肾小球，但近年研究表明，DN早期肾损伤与肾小管关系密切，不仅可反映DN炎症和纤维化程度、氧化应激和重吸收能力，还与肾功能水平下降及DN病程进展密切相关[4]。DN肾小管结构改变主要包括肾小管基底膜增厚、肾小管萎缩、间质性炎症、间质纤维化和血管异常[5]。有研究显示，DN早期肾小球处于超滤状态，因此限制近端小管的重吸收是改善肾小球高滤过、延缓DN 病情的方法之一[6]，对DN 早期治疗及预后有重要意义。

中医药在缓解DN症状方面优于部分常规疗法，且不良反应少[7]。根据中医辨证，早期DN多属气阴两虚兼络脉瘀阻证。渴肾方为王琛教授根据多年临证经验，结合DN患者多见水瘀互结致水肿的临床表现，在消白方[8]基础上加减化裁，加入桂枝、茯苓健脾利水化湿，又以赤芍、水蛭及少量大黄活血化瘀，收效良好。本实验采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备DN 大鼠模型，观察渴肾方对模型大鼠肾小管间质损伤的影响，初步探讨其作用机制，为该方临床治疗DN提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

6周龄SPF级健康雄性SD大鼠50只，体质量160～180 g，购于上海斯莱克实验动物中心，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005，饲养于上海中医药大学实验动物中心，温度（23±3）℃，湿度55%±15%，12 h昼夜循环照明，自由摄食饮水。本研究经上海中医药大学伦理委员会审批（PZSHUTCM210806002）。

1.2 药物及制备

渴肾方由黄芪30 g、桂枝9 g、薏苡根30 g、鬼箭羽30 g、泽兰15 g、茯苓15 g、赤芍15 g、水蛭9 g、蚕茧壳9 g、制大黄6 g组成，由上海中医药大学附属曙光医院制剂科制成水煎液，每毫升水煎液含原药材9 g。恩格列净片，德国勃林格殷格翰有限公司，10 mg/片，批号E27235，用蒸馏水制成0.86 mg/mL混悬液。

1.3 主要仪器与试剂

Nikon80i荧光显微镜+数码成像系统，日本Nikon公司；卓越金采血糖仪，瑞士Roche公司；Certrifuge离心机，德国Eppendorf公司；Mini-PROTEAN Tetra电泳及转膜仪，美国Bio-Rad公司；Tanon2500凝胶成像系统，上海天能。STZ，德国Sigma，货号s0130；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体，武汉博士德，货号BM0002；CD68抗体，美国Santa Cruz公司，货号sc-70761；纤维连接蛋白（FN）抗体，英国Abcam公司，货号ab45688；β-actin 抗体，美国Proteintech 公司，货号66009-1-Ig；白细胞介素（IL）-6抗体，武汉爱博泰克公司，货号A11115；Masson三色染色液，珠海贝索生物，货号BA4079A；PAS染色液，珠海贝索生物，货号BA4080A；ECL 化学发光试剂盒，美国Thermo Scientific公司，货号34095。

2 实验方法

2.1 造模

大鼠适应性饲养1周后，按体质量随机分为正常组10只和造模组40只，造模组予高糖高脂饲料（猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%、基础饲料59%）喂养8周，正常组予基础饲料喂养。8周后造模组禁食12 h，腹腔注射1%STZ 溶液30 mg/kg[9]（临用前以0.1 mol/L、pH 4.4枸橼酸缓冲液溶解），72 h后检测大鼠随机血糖，以随机血糖≥16.7 mmol/L、尿糖阳性并稳定5 d，2周后检测尿蛋白定性阳性，即为造模成功[10]。

2.2 分组及给药

剔除死亡及未成模大鼠10只，将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、渴肾方组和恩格列净组，每组10只。以成人标准体质量（60 kg）的10倍计算大鼠每日给药剂量，恩格列净组为1.72 mg/只，渴肾方组为18 g/只，正常组和模型组予生理盐水2 mL/只，连续8周。给药期间除正常组外，其余组继续予高糖高脂饲料喂养。

2.3 取材

给药第8周末，代谢笼留取大鼠24 h尿液。大鼠禁食12 h，尾静脉采血检测空腹血糖，以2%戊巴比妥钠腹腔注射（2 mL/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，摘取左肾，一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，经石蜡包埋后制成3 μm切片，用于肾组织病理观察及免疫组化染色，另一部分置于-80 ℃液氮中保存，用于Western blot检测。

2.4 大鼠血清及尿液生化指标检测

血液及尿液样本离心后取上清液，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清胆固醇含量；采用免疫散射比浊法检测尿白蛋白，GOD法检测尿肌酐，计算尿白蛋白/肌酐比率（UACR）。以上检测均由上海中医药大学附属曙光医院检验科协助完成。

2.5 肾组织病理观察

2.5.1 PAS染色

肾组织切片脱蜡至水，于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡20 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各10 min，梯度乙醇（95%、90%、80%、70%）各5 min，蒸馏水洗，PBS洗3次，每次3 min，置于过碘酸乙醇溶液染色10 min，流水洗后去离子水洗3次，Schiff溶液染色15 min，流水冲洗，苏木素染核1 min，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗，中性树胶固定，显微镜下观察肾组织病理形态。

2.5.2 Masson染色

肾组织切片脱蜡至水，于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡20 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各10 min，梯度乙醇（95%、90%、80%、70%）各5 min，蒸馏水洗，苏木素染核1 min，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗，丽春红溶液染色10 min，蒸馏水冲洗，1%磷钼酸处理5 min，1%苯胺蓝复染10 min，1%冰醋酸分化1 min，中性树胶封片，显微镜下观察肾组织胶原纤维沉积情况。

2.6 免疫组化染色

肾组织石蜡切片脱蜡复水后，EDTA 抗原修复20 min，PBS冲洗后滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，分别滴加α-SMA、CD68一抗（1∶500），37 ℃孵育60 min，PBS 冲洗后加二抗，室温孵育15 min，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，计算阳性表达的平均光密度（MOD）。

2.7 Western blot检测

肾组织用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，制备蛋白样品。蛋白上样后120 V电泳60 min，湿转法100 V转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，滴加FN 一抗（1∶3 000）、IL-6 一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃摇床孵育过夜，滴加HRP标记IgG（1∶1 000），室温孵育1 h，PBST洗3次，ECL发光液显影，凝胶成像系统成像，以β-actin为内参，采用Image J软件计算目的蛋白相对灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS28.0 统计软件进行分析。计量资料用-±s表示，多样本均数比较，符合正态分布及方差齐性用方差分析，组间比较用LSD法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 渴肾方对模型大鼠空腹血糖、血清胆固醇、尿白蛋白/肌酐比率的影响

与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖、血清胆固醇、UACR明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，渴肾方组和恩格列净组大鼠空腹血糖、血清胆固醇及UACR明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 给药8周末各组大鼠空腹血糖、血清胆固醇、UACR比较（-±s）

表1 给药8周末各组大鼠空腹血糖、血清胆固醇、UACR比较（-±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

UACR/（mg/g）1.53±0.73 5.29±0.95**3.14±0.62#2.67±0.62#组别正常组模型组渴肾方组恩格列净组只数5 5 5 5空腹血糖/（mmol/L）5.46±0.51 21.20±2.23**15.92±6.16#11.65±2.58#血清胆固醇/（μmol/L）1.43±0.15 2.98±1.46**1.63±0.22#1.90±0.38#

4.2 渴肾方对模型大鼠肾组织病理形态的影响

PAS染色显示，正常组大鼠肾小球形态正常，无基底膜增厚及系膜基质增生，肾小管无水肿、空泡样变，肾间质无炎性细胞浸润和纤维组织增生；模型组大鼠可见系膜基质增生、基底膜增厚，肾小管上皮细胞空泡样变，肾间质有大量炎性细胞浸润；渴肾方组和恩格列净组大鼠系膜基质轻度增生，基底膜轻微增厚，肾小管轻度水肿，肾间质少量炎性细胞浸润，肾小管及间质损伤较模型组有一定程度减轻。见图1。

图1 各组大鼠肾组织形态（PAS染色， 标尺=100 μm）

Masson染色显示，正常组大鼠肾小球毛细血管结构清晰，肾小管结构完整，肾间质无纤维化改变；模型组大鼠肾小管基底膜增厚，部分上皮细胞空泡变性，肾间质大量胶原纤维沉积；与模型组比较，渴肾方组和恩格列净组大鼠肾小管基底膜增厚改善，肾间质胶原纤维沉积明显减少。见图2。

图2 各组大鼠肾组织形态（Masson染色， 标尺=100 μm）

4.3 渴肾方对模型大鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白、CD68表达的影响

α-SMA阳性表达呈棕黄或褐色颗粒，CD68阳性表达呈蓝紫色颗粒。正常组大鼠肾组织未见α-SMA和CD68阳性表达；与正常组比较，模型组大鼠肾组织α-SMA和CD68阳性表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，渴肾方组和恩格列净组大鼠肾组织α-SMA和CD68阳性表达明显降低（P＜0.05）。见图3、图4、表2。

图3 各组大鼠肾组织α-SMA阳性表达（免疫组化染色， 标尺=100 μm）

图4 各组大鼠肾组织CD68阳性表达（免疫组化染色， 标尺=100 μm）

表2 各组大鼠肾组织α-SMA、CD68表达比较（-±s，MOD）

表2 各组大鼠肾组织α-SMA、CD68表达比较（-±s，MOD）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

CD68 0.033±0.001 0.242±0.004**0.078±0.008#0.143±0.002#组别正常组模型组渴肾方组恩格列净组只数4 4 4 4 α-SMA 0.040±0.006 0.411±0.056**0.198±0.047#0.250±0.046#

4.4 渴肾方对模型大鼠肾组织纤维连接蛋白和白细胞介素-6蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾组织FN、IL-6蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，渴肾方组和恩格列净组大鼠肾组织FN、IL-6表达明显降低（P＜0.05）。见表3、图5。

图5 各组大鼠肾组织FN、IL-6蛋白免疫印迹

表3 各组大鼠肾组织FN、IL-6蛋白表达比较（-±s）

表3 各组大鼠肾组织FN、IL-6蛋白表达比较（-±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

IL-6 0.55±0.15 0.94±0.05**0.61±0.16#0.49±0.20#组别正常组模型组渴肾方组恩格列净组只数4 4 4 4 FN 0.56±0.23 1.13±0.18**0.78±0.09#0.66±0.27#

5 讨论

DN 进展的最主要危险因素是高血糖、高血压[11]，在高糖环境下，近端肾小管重吸收功能失衡可导致形态变化，致使炎症、纤维化发生，加速DN 进展[12]。DN患者高血压与胰岛素抵抗、胰岛素分泌缺乏导致的糖脂代谢紊乱及动脉粥样硬化相关。高血压可使管-球反馈机制出现障碍，导致肾小球滤过功能异常，出现蛋白尿。蛋白尿是DN进展的重要指标之一，因此，改善糖脂代谢水平对减少DN 患者尿蛋白排出，延缓DN进程有一定作用。

胰岛炎症引起的胰岛素抵抗是糖尿病发生的重要诱因[13]。CD68是一种高度糖基化的糖蛋白，在巨噬细胞和其他单核细胞中高度表达。研究表明，巨噬细胞极化是炎症反应的关键原因，参与胰岛炎症反应，直接影响DN的发展[14]。慢性肾损伤的普遍特征是由免疫介导的肾间质纤维化[15]，肌成纤维细胞分化被认为是肾纤维化发展的重要表现之一[16]。α-SMA是活化的肌成纤维细胞标记蛋白[17]，是肾组织纤维化标志物之一[18]。Gerrits等[19]研究表明，DN肾间质中肌成纤维细胞累积可加速肾间质纤维化形成。在一定条件下，巨噬细胞甚至可以转化为肌成纤维细胞，直接介导肾间质纤维化[20]。炎症可加重肾脏疾病进展[21]，炎性细胞浸润和间质纤维化与多种炎症因子分泌有关[22]。IL-6是DN炎症反应进展的核心指标之一[23]，在肾组织中广泛表达。一项临床观察显示，IL-6水平是DN进展的独立危险因素[24]。炎症因子可通过激活多种信号通路导致肾纤维化，肾纤维化是多种慢性肾病的最终表现[25]。FN是细胞外基质和基底膜中的主要非胶原性糖蛋白，由成纤维细胞、间充质细胞分泌合成的细胞纤连蛋白构成，与纤维化进程密切相关[26]。肾小管间质纤维化是DN的关键病理特征[27]，因此，选取观察炎症及纤维化相关蛋白表达与病理相符，可更加客观评价渴肾方的疗效。本实验中，渴肾方组大鼠UACR较模型组明显改善，故对DN大鼠肾组织进行病理检测，以证实其有效性。PAS染色显示，与模型组相比，渴肾方组在改善肾间质炎性浸润等方面有明显作用；Masson染色显示，与模型组相比，渴肾方组在改善肾间质纤维化方面有一定效果，也从一定程度上表明，渴肾方可能是通过减轻炎症反应延缓肾纤维化进程。为进一步验证这一猜想，选取炎症与纤维化相关指标进行验证。免疫组化染色结果表明，渴肾方组大鼠肾组织CD68、α-SMA阳性表达明显低于模型组，Western blot结果表明，与模型组相比，渴肾方组大鼠肾组织IL-6、FN蛋白表达明显降低。表明渴肾方可能通过减轻肾组织炎症反应，抑制纤维化发生，延缓DN进展。

DN属中医学“消渴病”之“下消”或“消肾”等范畴。《太平圣惠方》有“夫消肾，小便白浊如脂者。此由劳伤于肾，肾气虚冷故也”，其症状与DN 临床表现相符。中医学认为，早期DN病机为本虚标实，以阴虚为本，燥热为标。渴肾方中以黄芪为君，取其益气健脾、利水消肿之效，臣以桂枝温通经脉、助阳化气，二药相合，意在调和营卫、益气化湿，使中焦之气得以运化，下焦之寒得以温煦；薏苡根清热通淋、健脾利湿，泽兰利水消肿、活血化瘀，茯苓利水渗湿、健脾宁心，赤芍清热凉血、散瘀止痛，鬼箭羽破血通经、解毒消肿，水蛭逐瘀消癥，制大黄活血通经、推陈致新，以上共为佐药，以加强健脾利湿、益气化瘀之功；蚕茧壳祛风胜湿、调和诸药为使。诸药相合，奏健脾益气、化湿通络之功。

综上所述，渴肾方能改善DN 大鼠肾小管间质损伤，其作用机制可能是通过抑制CD68、IL-6表达减轻炎症反应，抑制α-SMA、FN表达，抑制肾间质纤维化发展，从而延缓DN进程。