SARS-CoV-2的RT-RAA快速检测方法建立与应用

章文,艾乐乐,谭伟龙,冯茜,钱宇清,薛松△（.江苏省第二中医院,江苏 南京 0000;.东部战区疾病预防控制中心,江苏 南京 0000）

冠状病毒（coronavirus，CoVs）是一种有包膜、非节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科。该亚科由α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属和δ冠状病毒属共四个属组成[1]。目前主要采用qPCR方法对病毒核酸进行检测和定量，该方法具有高度的灵敏度和特异性[2]。自COVID-19暴发以来，许多实时qPCR（RT-qPCR）检测试剂被开发出来，并且用于SARS-CoV-2的实验室检测[3]。但qPCR的检测需要专业的人员和较精密的实验设备，且检测时间至少需要1.5小时[4-6]。由于SARS-CoV-2疫情在全球范围内流行，出现了大量患者、无症状感染者和密切接触者，如何更加快速、准确检测SARSCoV-2对疫情防控至关重要。本研究建立单管逆转录重组酶介导扩增（Reverse transcription recombinase aided amplification，RTRAA）方法，检测SARS-CoV-2核衣壳（N）基因。运用商用RTqPCR试剂和RT-RAA方法对127人份临床咽拭子样本进行检测，检测结果一致性达100%。本研究建立的RT-RAA法检测SARSCoV-2，具有快速、灵敏、操作简单及设备要求低等特点，对于当前疫情下快速检测SARS-CoV-2具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 引物和探针设计 在NCBI数据库中下载20条SARS-CoV-2核酸序列，使用DNAMAN7.0软件对序列进行比对。在目标ORF1ab基因中发现一个保守区（GenBank：MT559038.1，position 3111-3406），根据这个区域设计RT-RAA引物和探针，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 RT-RAA方法建立 使用RT-RAA核酸扩增试剂盒（荧光法）（江苏奇天基因生物科技有限公司，中国）进行建立检测方法。反应体系共50μL，其中，纯化水，13μL；缓冲液Ⅵ，25μL；正向引物（10μM），2μL；反向引物（10μM），2μL；探针，0.5μL；DNA模板，5μL；乙酸镁，2.5μL。按照上述反应体系（除模板DNA和乙酸镁外）配置混合液，将混合液手弹混匀短暂离心，加入42.5μL混合液至荧光基础反应单元中，轻柔手弹，使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心将液体收集至管底，然后于每个反应单元管盖上加入2.5μL乙酸镁溶液，之后向各反应单元中加入模板DNA或阴性质控品，充分混匀并离心。而后再将反应单元转移到QT-RAA-F1620仪器（江苏奇天基因生物科技有限公司，中国）中，扩增条件设定在39℃，反应时间30分钟。

1.3 RNA提取 使用病毒核酸提取试剂盒（TAKARA，大连，中国）提取106名疑似COVID-19患者的咽拭子样本中的病毒核酸。取200ul咽拭子病毒液，经过病毒裂解，核酸提取，用40ul RNase free dH2O洗脱后，放入-80℃冰箱保存备用。

1.4 灵敏度实验 委托上海生工合成序列CTGCTCTTCAACCTGAA GAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAA CTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTAC TATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAAC TTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTT ATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAA AATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGG TAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAA TGTTTACCTT构建含新型冠状病毒基因序列质粒，载体：PUC57；载体大小：2710bp；克隆位点：SmaI；宿主菌：DH5α；抗性：氨苄。拷贝数（拷贝/μL）=｛[6.02×1023]×[质粒浓度（ng/μL）×10-9]｝/[DNA长度×660]）。将质粒梯度稀释为106、105、104、103、102、101、100拷贝/μl 7个浓度，依次对上述定量样品利用RT-RAA反应扩增体系进行测定，评价检测方法的灵敏度。将ORF1ab基因的一段保守序列（GenBank: MT559038.1，position 3111-3406）构建到质粒上，载体：PUC57；载体大小：2710bp；克隆位点：SmaI；宿主菌：DH5α；抗性：氨苄。

1.5 特异性实验 选用5种呼吸道病毒对本实验的特异性进行验证。用腺病毒3型、7型、55型，甲型流感病毒（2009H1N1，H3N2）和阳性样本核酸作为模板，评价RT-RAA方法的特异性。5种呼吸道病毒核酸在本实验室保存。

1.6 两种方法对临床样本检测 收集了106名新型冠状病毒患者和疑似人员的咽拭子，所有样本均由专业人员在P2实验室中进行核酸的提取和检测，提取的核酸样本用RT-RAA和商用RT-qPCR两种方法进行检测。

2 结果

2.1 灵敏度检测 以梯度稀释106-100copies/μl的7个RNA样本为模板，验证RT-RAA方法的检测灵敏度。结果显示该方法在模板浓度为106-101copies/μl时，均表现出良好的扩增曲线，100copy/μl时无扩增曲线。该检测方法的最低检测浓度为10copies/μl。当模板浓度大于103copies/μl时，反应在第10分钟时就表现出良好的扩增曲线。见图1。

图1 RT-RAA检测方法灵敏度检测

2.2 特异性检测 特异性检测结果显示，阳性对照和阳性样本均表现出良好的扩增曲线，腺病毒3型、7型、55型，甲型流感病毒（2009H1N1，H3N2）和阴性对照均无扩增曲线。由此可知该检测方法表现出良好的特异性。见图2。

图2 RT-RAA检测方法特异性检测

2.3 临床样本的检测 使用商用RT-qPCR和RT-RAA检测方法对106名COVID-19患者和疑似感染者的临床咽拭子样本进行检测，32个阳性和74个阴性样本用这两种检测方法结果一致，说明该RT-RAA检测方法具有良好的稳定性，适合推广应用。

3 讨论

据报道，SARS-CoV-2主要通过飞沫传播，人感染SARSCoV-2并出现症状后，鼻咽部的病毒载量更高[7]。早期发现、早期隔离和治疗对防止病毒传播和临床治疗具有重要意义。目前对COVID-19的诊断主要依靠RT-qPCR的方法，中国卫生机构通过大量的RT-qPCR检测，精准定位传染源，采取有效的隔离措施，最终国内COVID-19已得到遏制，但其在全球其他国家仍在迅速传播。由于RT-qPCR方法需要精密的仪器设备、专业的操作人员和较长的检测时间，许多不发达国家很难进行大规模检测。RT-RAA方法具有操作简单、检测用时短和高灵敏度等特点，这对SARS-CoV-2感染的早期诊断和及时采取卫生措施具有重要意义[8]。

本实验建立的SARS-CoV-2的RT-RAA方法，采用重组酶介导的等温扩增法检测SARS-CoV-2核酸。该方法利用重组酶能够在常温下实现DNA解链并快速进行扩增，不依赖精密设备、反应快速。该方法所使用的RAA荧光检测仪体积较小，便于携带，只需提供39℃等温环境，电量消耗小，使用锂电池即可运行，适用于现场快速检测。当检测核酸浓度大于103copies/ul时，可在10分钟内检测出阳性样本。该方法的灵敏度可达到10copies/ul，与RT-qPCR的检测灵敏度接近。运用该方法检测5种呼吸道病毒和SARS-CoV-2阳性样本，只有阳性样本出现扩增曲线，其他5种呼吸道病毒均未出现扩增曲线，表现出良好的特异性。使用RTRAA和商用RT-qPCR方法对106名COVID-19患者和疑似感染者咽拭子样本进行检测，两种方法的一致性为100%，表现出良好的稳定性，该种方法的检测结果值得信赖。

本研究建立的RT-RAA检测方法较现有的RT-qPCR方法具有操作简单、检测时间短、灵敏度高、特异性强等特点，为COVID-19疫情的快速诊断提供了准确可靠的检测技术，为此次疫情提供了更加低成本的检测方法。