Ca2+、琼脂及其协同效应对噬菌体分离的影响

薛佳桢,尚玉珠,任安琪,王云平,刘佳琪,李伟忠

（1.潍坊学院 种子与设施农业工程学院，山东 潍坊 261061；2.潍坊学院 生物与海洋学院，山东潍坊 261061）

寻找新的治疗策略应对由多重耐药菌（MDR）引起的感染成为了当今世界关注的热点，而变“治病主”为“治环境”的治疗策略，可通过影响环境中病原菌的分布和密度以达到治疗目的[1]。生态环境中细菌的天然捕食者—噬菌体，在医疗、农业和食品等领域中受到人们广泛关注[2-5]，尤其在生活生产环境、设备及农产品的消毒环节中。噬菌体分离的基础是样品中病毒粒子能否生成可见的噬菌斑[6]，高丰度和大成斑直径是目标菌斑筛选的条件，影响这两个条件的因素，必然会对噬菌体的分离效率和保留分离噬菌体的生物多样性具有重要意义。通常在添加0.2%-0.7%琼脂的半固体培养基内筛选噬菌体单斑，单斑直径大小与琼脂浓度呈负相关[7-9]，因此选择适宜琼脂浓度对噬菌体分离筛选至关重要。研究发现许多噬菌体附着宿主或胞内生长需要1-10mM 的Ca2+，具有增强分离效果[6,8,10]，噬菌体生成量显著提高[8]。噬菌体生成量/效价以成斑数（PFU）计量，菌斑个数与单斑直径之间具有依存关系：当单斑直径太小，常规视野下未能识别，则无法计数造成效价降低；当一个感染中心释放病毒粒子增多，高梯度势能下粒子向外扩散变强，菌斑直径相应扩大，则更易识别而效价增大。关于琼脂对病毒粒成斑数量的影响和Ca2+对病毒成斑直径的影响鲜有报道，因此，本试验以大肠杆菌为指示菌和噬菌体P1 为模型，评价Ca2+和琼脂对病毒成斑个数及直径的影响，验证试验因素间是否存在协同作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大肠埃希氏杆菌(E.coliATCC 25922)和E.coli噬菌体（P1），均由潍坊学院现代设施渔业研究院提供。LB 培养基、琼脂及相关试剂均为国内产品。

主要试验仪器包括恒温培养箱、高压灭菌锅、细菌浊度仪、恒温振荡摇床、低温高速离心机、电子天平和漩涡混合器等。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配制

底层LB 固体培养基：在1L 的LB 培养基中加入18g 琼脂。

上层LB 半固体培养基：琼脂添加量见表1。

表1 试验分组与设计

1.2.2 指示菌液制备

将宿主菌划线接种于固体LB 培养基上，放置于37℃恒温培养箱过夜培养，用200μL 枪头环挑取单菌落接种于20mLLB 液体培养基，37℃、160 g·min-1振荡培养至对数生长期，用LB 培养基调整至0.5MCF（约1×108 CFU·mL-1），4℃保存备用。

1.2.3 噬菌体成斑评价

将噬菌体原液利用PBS 缓冲液进行10 倍梯度稀释，分别取100μL 各个梯度的噬菌体稀释液与制备菌液100uL 混合，静止5min 后，加入含有（8-10mL） 48-60℃半固体LB 培养基的10mL 离心管中，上下颠倒混匀三次，快速倒入下层固体LB 平板中，晃动培养皿使其完全覆盖，冷却5min 左右，37℃倒置培养12h，观察菌斑形态并统计个数，计算噬菌体效价。

1.2.4 试验设计及分组

在1.2.3 试验操作中，各组依据表1 试验设计进行配制上层LB 培养基，每组3 次重复。

1.3 数据统计与分析

用Graph Pad Prism 9.1 软件对菌斑计数结果进行双因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 Ca2+对噬菌体成斑的评价

由图1 和表2 试验结果可以看出：与无钙组相比，添加Ca2+组的培养基中噬菌体效价显著增大（P＜0.01）；与处理组Ⅰ相比，Ⅲ组的单斑目测直径更大且更加透亮，晕圈不明显。结果表明菌斑的生成数量与形态特征均受Ca2+的影响。

图1 噬菌体在不同LB 半固体培养基中成斑观察

表2 噬菌体在不同LB 半固体培养基中的效价(mean±SD)

2.2 琼脂对噬菌体成斑的评价

由图1 和表2 试验结果可以看出：与高浓度琼脂(0.70%)相比，低浓度琼脂(0.35%)培养基中成斑个数显著增大（P＜0.01），目测直径也明显变大。结果表明菌斑的生成数量与形态特征均受琼脂的影响。

2.3 Ca2+×琼脂协同效应对噬菌体成斑的评价

由图1 和表2 试验结果可以看出：在同一视野下，P1 在Ⅲ组培养基中噬菌斑目测直径最大且清亮；P1在Ⅲ组培养基中生成量最高，差异显著（P＜0.01），琼脂与Ca2+存在协同效应（P＜0.01）。

3 讨论

噬菌体存在于水、土壤和沉积物的微生物生态系统中，贮量丰富，预估为1030-1032[11]。环境中噬菌体丰度虽高，但特定噬菌体时常难以分离而采用噬菌体的富集技术[9,12]。噬菌体富集过程令噬菌体的多样性丧失，仅分离出占优势且可有效繁殖的病毒。双层琼脂平板法是分离噬菌体的传统方法，根据菌斑的形态特征而进行筛选目标。菌斑的形成中进行“反应-扩散”交替过程[13]，以感染中心为起点，伴随菌斑的产生，一种或多种菌苔菌被噬菌体感染，释放出的病毒粒子部分向外扩散，与其他细菌碰撞，然后感染其他细菌。病毒粒子向外呈被动扩散方式，从高浓度向低浓度迁移，势能影响扩散速率，感染中心释放病毒粒子越多则迁移速率越高；另外病毒粒子扩散速率也受琼脂密度的影响[6,13,14]。因此，在规定时间内扩散速率越高，菌斑直径就越大，更易被观察，效价才能不被低估。

为确定噬菌体是否为需Ca2+型，顶层培养基中分别添加50mM 柠檬酸盐和1-10mM Ca2+，若需Ca2+，效价则明显降低[6]。当添加10mM Ca2+时，噬菌体Lc、Lpen 和Lbre 的效价比未添加Ca2+时增加达2-4 个数量级[8]。但在开展噬菌体分离试验研究时，通常添加1-2mM Ca2+[6,15]，缩短噬菌体与指示菌吸附时间[6]，菌斑直径就越大[13]，以提高分离效率。添加Ca2+组，P1 效价明显增加（见表2），结果与前人研究一致，但对菌斑形态特征的影响鲜有报道。本试验发现处理组Ⅲ生成噬菌斑平均直径更大且更清晰（图1 Ⅰ和Ⅲ），这与Ca2+能提高感染中心噬菌体产量[8]密切相关。另外晕圈在Ⅰ组清晰可见是由于裂解酶扩散速率高于病毒粒子[13,16]，而Ⅲ组不明显可能因为病毒粒子的高势能下的扩散速率与裂解酶扩散速率相当，掩盖了晕圈的痕迹。以上提示噬菌体分离时，Ca2+还兼具有扩大菌斑直径作用，避免菌斑太小而利于分离纯化。

在生长培养基中通常添加琼脂以防止培养液流动或混合，以限制物质的扩散。病毒粒子的扩散速率受琼脂密度、分子长度和纯度等因素的影响，导致噬菌斑直径发生变化[13]，因此一般推荐琼脂添加量为0.2%-0.7%进行噬菌体的分离[6,7,17]。Ellis 和Delbrück 研究发现[14]，顶层培养基中分别添加0.75%、1.5%和3.0%琼脂，菌斑直径分别为2、0.5 和0.2mm，琼脂浓度与菌斑直径成反比，这与本试验结果相符（图1）；但在添加高于0.75%琼脂的培养基中，噬菌体成斑数量无明显变化[14]，这与本试验结果相悖（表2），这可能是高浓度琼脂及病毒粒子物理特性共同阻滞此病毒粒子的扩散速度[13]，在规定时间内部分感染中心不可见。本试验发现低浓度琼脂培养基中，能明显增加菌斑的产量，提示噬菌体分离时适当的低琼脂浓度，可提高样品中待选噬菌体的分离效率。

关于琼脂与Ca2+是否存在协同关系，共同对噬菌体成斑状况产生影响还未见报道。试验发现Ca2+(2)×琼脂(0.35)试验组，效果最佳，两因子间存在协同关系。其原因是病毒粒子数量与其成斑大小密切相关，其中一方变化，另一方随之发生响应，此关系从上述结果中已得到证实。本研究提示：待选噬菌体的分离过程，要关注Ca2+与琼脂的组合效应。

4 结论

本试验中Ca2+、琼脂及其协同对噬菌体P1 的成斑状态具有显著的影响，成斑状态主要体现于成斑数量与噬菌斑直径两方面，能有效提高环境中病毒分离效率，尽可能增加噬菌体的多样性，为清除病原菌提供更加多元的选择，以提高特定病原菌的覆盖度，为噬菌体制剂产业化奠定理论基础。