老年护理医院长期住院患者肠道耐碳青霉烯类肠杆菌携带分析

李奇,薛坚,张泓

1. 上海市儿童医院/上海交通大学医学院附属儿童医院检验科,上海 200062; 2. 上海市金山区众仁老年护理医院检验科,上海 201501

耐碳青霉烯肠杆菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae, CRE)是临床上常见的多重耐药菌,在医院环境中可以通过人物间或人际间的直接接触发生播散或转移定植[1]。携带CRE的患者可能成为医院内CRE的传播来源,尽早发现CRE有助于更好地预防和控制,因此2015年以来国内外多项指南建议对易感染CRE的高风险人群开展CRE定植的主动筛查,并建议将肠道标本作为筛查的优选标本[2]。老年护理医院的绝大部分患者具有住院时间长、高龄、深度的免疫衰老或伴有多种慢性疾病等临床特点,是易感染CRE的高风险人群[3]。近年来在综合性医院中对易发生CRE感染患者开展CRE肠道定植的研究较多,对老年护理医院住院患者肠道CRE的携带情况研究较少。本课题以主动筛查的方式对老年护理医院长期住院者肠道CRE的携带情况进行探讨,了解CRE肠道携带者的比例、临床特征以及CRE的分子特征,为进一步的控制干预措施提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料于2021年4月依据入选标准随机选取上海市金山区众仁老年护理医院220位60岁及以上长期住院者(住院时间≥90d)作为研究对象,收集相关病史资料,其中女性143位,男性77位,平均年龄(84.79±7.57)岁,平均住院时间为1 100.47 d。入选标准:(1)年龄≥60岁,住院时间≥3个月; (2)能自主排便; (3)入组患者采样前无肠道感染症状。所有研究均在医院伦理委员会的批准下进行(伦理批号:202007)。

1.2采集样本类型和频率首次采样在2021年4月2日全部完成,计划采集3次,隔1周采集1次,主要采集纳入患者的粪便样本,对于当日无粪便的患者则采集肛拭子样本[4]。若患者送检样本中检测出CRE,则判断该患者肠道有CRE携带,不再进行后续采样;若患者3次采集的粪便样本中均未发现CRE,则判断该患者肠道无CRE携带。

1.3仪器与试剂全自动细菌鉴定分析仪为VITEK-2 compact(法国生物梅里埃公司),鉴定卡为配套的GN卡;药敏纸片亚胺培南、美罗培南的品牌为OXOID;M-H培养基和CHROMagar KPC显色培养基购自于上海科玛嘉微生物科技有限公司, APB和EDTA试剂购自于珠海迪尔生物工程有限公司,所有试剂均在有效期内。阴性质控菌株ATCC25922来源于上海市临床检验中心,阳性质控菌株是经基因测序的KPC-2型肺炎克雷伯菌临床株。

1.4方法

1.4.1 CRE的筛查 (1)大便标本的采集和运送 按照《全国临床检验操作规程(第4版)》要求进行。(2)CRE的筛选 将大便样本接种于CHROMagar KPC显色培养基,于35 ℃温箱中培养18～24 h。依据CHROMagar KPC显色培养基使用说明书,将疑似CRE挑出并纯化,培养18～24 h后使用接种环挑取少许菌落置入含有1.5 mL胰大豆脑心浸液的菌株保存管中并混匀,随后放置在-22 ℃冷冻冰箱种保存。

1.4.2 CRE的鉴定与复核 菌株的鉴定 将冷冻保存的菌液恢复至室温,从中吸取200 μL转种于哥伦比亚血琼脂平板,培养18～24 h。使用仪器VITEK-2 Compact配套的GN卡进行菌种的鉴定。对鉴定为肠杆菌科的细菌,采用K-B法测定该菌对亚胺培南、美罗培南的耐药性,若对任意一种药物表现为耐药,则认为该菌为CRE。体外药敏试验折点的判断依据美国临床和实验室标准协会(clinicaland laboratory standardInstitute, CLSI)2022年M100文件[5]。

1.4.3 CRE耐碳青霉类药物表型检测 采用碳青霉烯酶抑制增强实验检测CRE耐碳青霉类药物表型,具体操作见参照文献[6]。产A类碳青霉烯酶:含APB的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5 m;产B类碳青霉烯酶:含EDTA的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5 mm;同时产A类碳青霉烯酶和B类金属酶:同时含APB和EDTA的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5 mm;不产A类或B类碳青霉烯酶:含酶抑制剂的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药相差均<5 mm。

1.4.4 产碳青酶烯酶基因检测 使用PCR检测CRE常见的5种产碳氢酶烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48),将分纯后的菌株送至上海派森诺生物科技有限公司进行PCR实验、凝胶电泳和基因测序,测序结果在NCBI上比对以确定基因型。PCR反应体系为25 μL:MIX液12.5 μL、模板2 μL、引物上下游各1 μL、双蒸水8.5 μL,反应条件设置为94 ℃预变性5min, 94 ℃变性 60S,退火30 S, 72 ℃延伸60 S,总共循环数为35个(退火温度和引物序列见下表1)。

表1 5种耐药基因PCR实验引物相关信息

2 结果

2.1肠道携带CRE的筛检结果220位患者中肠道CRE携带者的所占比为8.18%(18/220)。第1批次送检的220份粪便样本中,18份粪便样本中筛查出CRE;第2批次和第3批次202位无肠道CRE携带者的粪便样本中均未检测出CRE。在菌群分布上以CR-ECO为主,其所占比为50.00%(9/18);其次为CR-KPN,所占比33.33%(6/18),耐碳青霉烯阴沟肠杆菌(CR-ECL)2株,所占比为11.11%,耐碳青霉烯枸橼酸杆菌(CR-CFR)1株,所占比为5.56%,具体的筛检结果见表2。

表2 肠道携带CRE的筛检结果

2.2碳青霉烯酶表型及基因检测结果18株CRE均是产碳青霉烯酶CRE(CPE),碳青霉烯酶抑制增强实验显示11株CRE表达B类酶,所占比61.11%; 7株CRE表达A类酶,所占比为38.89%。在表达B类酶的菌株中, 7株为CR-ECO,所占比为63.64%;在表达A类酶的菌株中, 5株为CR-KPN,所占比为71.43%。分离的CR-KPN以产KPC(83.33%)为主, CR-ECO以产NDM(77.78%)为主。18株CRE中检测出2种碳青霉烯酶基因, 11株检测出blaNDM,检出率为61.11%;7株检测出blaKPC,检出率为38.89%,blaVIM、blaOXA-48和blaIMP均未检测出。

测序结果在NCBI网站BLAST比对,发现blaKPC的基因型均为blakpc-2型,而blaNDM有blaNDM-1和blaNDM-5两种亚型,blaNDM-1有8株,是主要的blaNDM亚型,同时blaNDM-5有3株,均被CR-ECO携带,具体的研究数据见图1。

(A) 碳青霉烯酶抑制增强实验和凝胶电泳结果 (B)碳青霉烯酶基因测序结果

2.3肠道CRE携带患者的基础临床资料由表3可知,统计分析发现CRE肠道携带组与无携带组住院者在年龄、性别、住院时间、慢性呼吸道疾病、慢性泌尿系统疾病、慢性心脏疾病、慢性胃肠道疾病、糖尿病、高血压、脑血管意外、长期卧床、 ICU转入、导尿管使用上的临床特征均无统计学差异(P>0.05),只有长期留置胃管(>30 d)差异有统计学意义(P<0.05),表明长期使用留置胃管(>30 d)的患者最有可能是CRE肠道携带者,具体数据见表3。

表3 肠道CRE携带患者基础临床资料

3 讨论

CRE可以在住院患者的胃肠道中存活而不引起任何感染症状,据报道,粪便CRE携带是发生CRE感染的重要危险因素,有CRE定植的严重疾病患者其感染CRE风险至少比没有CRE定植的患者高两倍,同时从感染控制的角度来看,区分CRE的耐药机制具有重要的感染控制意义[7]。本研究的目的是确定老年护理医院长期在院患者CRE的肠道携带率,阐明肠道携带CRE的表型和分子特征,发现潜在的肠道携带CRE的患者临床特征,为老年护理医院早期防控CRE提供依据。

西班牙的Aranzábal等[4]对马德里社区3家长期护理医院开展肠道携带CRE主动筛查时发现,肠道CRE平均携带率为4.1%,在菌群分布上以CR-KPN为主,其次才是CR-ECO。Yamamoto等[8]研究发现日本大阪北部长期护理医院住院患者肠道CRE的携带率为14.9%,菌群分布以CR-ECO为主,其次是CR-KPN,而比利时的研究者在1家老年护理医院未发现肠道携带CRE的患者[9]。在本研究中, CRE肠道携带者的所占比为8.18%,高于Aranzábal[4]等人的研究结果,但低于Yamamoto[8]等人研究结果, CRE的菌群分布与以上文章所报道的不尽相同,可见肠道携带CRE患者的检出率以及CRE的菌属分布的差异与患者所在区域的医疗环境有关。

随着亟需长期恢复治疗的老年患者向老年护理医院转移, CRE有从综合性医疗机构向老年照护机构播散的风险。研究发现日本大阪长期护理医院住院患者肠道携带CRE中95.7%的菌株是携带blaIMP的CPE,同时期当地综合性医院最流行的碳青霉烯酶是IMP型[8,10]。Aranzábal等[4,11]发现OXA-48是西班牙马德里长期护理医院患者肠道携带CPE产生的主要碳青霉烯酶,同时期该地区流行的CPE主要携带blaOXA-48。本研究中肠道携带CR-KPN以产KPC(83.33%)为主, CR-ECO以产NDM(77.78%)为主,与全国范围36家综合性医院流行CRE的产碳青霉烯酶分布情况相符[12]。可以发现不同地域老年护理医院住院患者肠道携带CPE表达的碳青霉烯酶与同区域流行CPE的产碳青霉烯酶型别相似,可能是携带CRE的患者由综合性医院向老年护理医院转移导致这种相似。本次研究发现老年护理医院肠道携带blaNDM的CPE检出率较高,携带blaNDM-5的均是CR-ECO,考虑到blaNDM-5菌株的播散风险,临床上应关注住院患者的肠道CRE的携带情况[13]。

外源性因素是医院患者获得CRE的主要原因,及时发现携带CRE高风险患者,可以指导临床及时采取额外的干预措施限制CRE的播散,但不同类别机构的住院患者肠道携带CRE的因素不尽相同。Yamamoto[8]等研究发现肠道携带CRE患者危险因素是长期住院时间、肠内营养和抗菌药物暴露史,其中肠内营养是最高的危险因素。也有研究结果显示高危科室住院患者中年龄≥60岁、留置胃管是肠道发现CRE阳性的危险因素[14]。本组研究发现侵入性操作的长期使用留置胃管(>30d)的患者最有可能是CRE的肠道携带者,与以上老年患者CRE肠道定植的高危因素结果相符,建议老年护理医院应对长期使用留置胃管(>30d)的患者加强CRE的防控措施。防控CRE的措施有多种,对于老年护理医院等类似的养老机构还应当加强生活照护护理员的培训与监督[15]。

综上所述,老年护理医院长期住院者中有较高比例的CRE肠道携带者,肠道携带CRE的分子特征提示有播散的风险,长期使用留置胃管(>30 d)的住院者最有可能是CRE的肠道携带者,因此建议老年护理医院应对刚入院以及长期住院者开展定期的肠道CRE筛查,临床上应采取适当的干预措施控制应对肠道CRE的携带定植。