丹参-红花配伍调控未折叠蛋白应答改善糖尿病心肌病小鼠心脏功能研究

许美玲,邢宝彤,李建萍

(南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

糖尿病是引发心血管疾病的重要风险因素[1],糖尿病患者发生心血管疾病的风险要比正常人高2～3倍[2-3]。一方面,糖尿病会加快高血压和冠状动脉疾病的进程,增加心肌梗死和心力衰竭的发生率和死亡率[4];另一方面,糖尿病本身对心脏也是有害的,在没有高血压或冠状动脉疾病的情况下,也会独立地引发心脏疾病[5]。糖尿病是引发心衰的独立风险因素,而这种直接由糖尿病引起的心脏结构和功能障碍就是糖尿病心肌病[6-7]。糖尿病心肌病当前缺乏有效的特异性防治药物[8]。由于糖尿病是推动糖尿病心肌病发生发展的始动因素和病理基础,采用降糖药物改善糖尿病症状是糖尿病心肌病的基本防治方法[5]。但是,2型糖尿病患者在成功控制血糖后,微血管和大血管病变的残留风险依旧非常高[9]。尤其在年老、有心血管疾病史或有其他心血管风险因素的2型糖尿病患者中,如果强化血糖控制,反而会加剧心衰的发生风险[10]。因此,寻找针对糖尿病心肌病的特异性治疗靶点和药物仍有很大的前景和挑战[5]。

在我国医药文化发展中,药食两用的中药材逐渐成为人们保健养生的关注热点,促进了药食两用中药材的发掘与研究。丹参和红花均为药食两用的中药材,丹参为唇形科植物SalviamiltrorrhizaBge.的干燥根及根茎,具有活血祛瘀,调经止痛,清心除烦的功效;红花为菊科植物CarthamustinctoriusL.的干燥管状花,具有活血通经,祛瘀止痛,疏肝通络的功效。2020年发表的综述在总结丹参-红花配伍通过多成分、多靶点、多途径改善肥胖、高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化等疾病的基础上,提出丹参-红花配伍对糖尿病及心血管并发症的防治潜力,但是丹参-红花配伍对糖尿病心肌病或者糖尿病并发心血管疾病的防治作用及机制仍需临床试验的验证及基础研究的探索[11]。课题组最近研究发现,丹参-红花配伍可以显著改善糖尿病心肌病小鼠的心脏功能障碍[12]。但是,该研究中丹参-红花配伍水提物的给药方式为腹腔注射,在临床应用中具有局限性,本文设计了2种口服给药的方式,评价丹参-红花配伍口服给药对糖尿病心肌病小鼠糖尿病症状、葡萄糖代谢能力及心脏功能的作用。同时以未折叠蛋白应答信号通路异常这一糖尿病心肌病的关键病理机制为切入点[13],探讨丹参-红花配伍口服给药对糖尿病心肌病小鼠的调控机制,以期为糖尿病心肌病的临床防治提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物

丹红注射液购自步长制药股份有限公司(DH,批号:22051003,丹参-红花配伍水提物的生药量为29 mg·mL-1,丹参和红花以3∶1的比例配伍,采用水提醇沉法制得);恩格列净(Empagliflozin,EMPA)购自德国Boehringer Ingelheim公司(批号:004345)。

1.2 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠(20～25 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2021-0006。小鼠饲养在南京中医药大学实验动物中心,环境温度为22 ℃,12 h黑暗和12 h光照循环,小鼠维持充足的饲料和饮用水。动物实验由南京中医药大学动物伦理委员会批准,批准号:201805A023,按照NIH实验动物护理和使用指南进行。

1.3 试剂

高脂饲料(High fat diet,HFD,Research Diets D12492,60%的能量来自于脂肪,5.24 kcal·g-1,1 cal=4.19 J)购自美国Research Diets公司(批号:1902702HS2.5);普通标准饲料(Normal standard diet,ND,3.30 kcal·g-1)购自江苏协同生物工程有限公司;链脲霉素(Streptozotocin,STZ)(批号:S0130)、柠檬酸钠(批号:S1804)、柠檬酸(批号:C0759)和羟乙基纤维素(批号:434973)均购自Sigma-Aldrich公司;葡萄糖购自上海麦克林生化科技有限公司(批号:G6172);小鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号:H203-1-2);葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物科技有限公司(批号:20180402137);胰岛素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批号:K1815025);纯化的小鼠anti-GRP78抗体购自美国BD公司(批号:610979,Western blot使用时抗体稀释1 000倍);GRP94的兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司(批号:20292,Western blot使用时抗体稀释1 000倍)。

1.4 仪器

Vevo 3100超声成像系统(VisualSonics Inc,加拿大);ENSPIRE多功能酶标仪(PerkinElmer,美国);Mini-PROTEAN电泳仪及其配件(BioRad,美国);ChemiDoc成像系统(BioRad,美国);ABI7500实时定量PCR(Applied Biosystems,美国)。

1.5 方法

1.5.1 动物实验设计 动物实验按照最新的天然产物药理学研究最佳实践指南进行[14-15]。实验共使用46只C57BL/6J雄鼠,其中21只小鼠随机分为空白对照组(CTL,n=10)和丹参-红花配伍长期预防给药组(DCM-DHOL,n=11),剩余25只小鼠造模后再分组。10只空白对照组小鼠用标准普通饲料喂养10周,并在第5周的第1天腹腔注射柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol·L-1,pH=4.5),其余36只小鼠用高脂饮食喂养10周,并在第5周的第1天腹腔注射STZ柠檬酸钠缓冲液(120 mg·kg-1)。在第8周的最后1天测定小鼠禁食2 h后的血糖水平,将未分组的25只小鼠中血糖值≥16.67 mmol·L-1的存活小鼠进一步分为糖尿病心肌病组(DCM,n=7)、丹参-红花配伍短期治疗组(DCM-DHO,n=7)以及恩格列净阳性药组(DCM-EMPA,n=7),分组时确保这3组的平均血糖值相同(图1)。给药方法为:丹参-红花配伍短期治疗组在第9～10周每天灌胃丹参-红花水提液(4.16 mL·kg-1);丹参-红花配伍长期预防给药组,在第1～10周每天灌胃丹参-红花水提液(4.16 mL·kg-1);恩格列净阳性药给药组,在第9～10周每天灌胃恩格列净-0.5%羟乙基纤维素溶液(10 mg·kg-1)。

注:ND.普通标准饲料;HFD.高脂饲料;STZ.STZ柠檬酸钠缓冲液;DH.丹参-红花水提液;EMPA.恩格列净-0.5%羟乙基纤维素溶液

1.5.2 糖尿病指标监测 动物实验期间,在每周的最后1天监测小鼠的体质量、饮水量、能量摄入以及血糖水平(禁食2 h),连续监测10周。最后1次给药后测定小鼠血清胰岛素水平,同时每组抽取3只小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)和胰岛素耐受试验(Insulin tolerance test,ITT)。实验方法参考文献[16],简述如下:小鼠禁食14 h后进行OGTT试验,根据小鼠体质量灌胃20%葡萄糖溶液(1 g·kg-1),在不同的时间点(0、15、30、60、90 min)进行尾尖取血,采用血糖仪检测血糖水平。小鼠休息1周后进行ITT试验,禁食4 h,根据小鼠体质量腹腔注射胰岛素溶液(0.75 U·kg-1),随后按照与OGTT试验一样的方法进行血糖检测。

1.5.3 心脏功能检测 在小鼠最后1次给药后,采用Vevo 3100成像系统对小鼠进行超声心动图检查,评价其心脏功能。在小鼠清醒状态下,获得M模式下心脏的胸骨旁短轴视图,并测量左心室缩短分数(Left ventricular fractional shortening,FS),评估心脏收缩功能。麻醉状态下,从心尖四室视图获取小鼠二尖瓣血流脉冲多普勒图,计算早期充盈速度与心房充盈速度之比(The ratio of peak early filling velocity to atrial filling velocity,MV E/A),评价心脏舒张功能。超声心动图检查由南京医科大学第一附属医院的超声心动图检查专家进行,其对小鼠的造模方法和给药情况不知情。

1.5.4 未折叠蛋白应答信号通路上关键转录因子水平检测 超声心动图检查后,处死所有小鼠,收集左心室并储存于-80 ℃备用分子生物学分析。采用qPCR对小鼠左心室未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)通路相关转录因子的mRNA水平进行检测,包括肌醇依赖酶(Inositol requiring enzyme 1,IRE1)、剪切的X盒结合蛋白1(Spliced x-box binding protein 1,Xbp1s)、葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulating protein 78,GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(Glucose regulating protein 94,GRP94)、胰激酶R-样内质网激酶(Pancreatic kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、激活转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)和激活转录因子6α(Activating transcription factor 6α,ATF6α),这些转录因子和内参基因的引物序列如表1所示[17]。采用Western blot实验检测小鼠左心室中GRP78和GRP94的蛋白表达量,其抗体浓度分别为0.25 μg·mL-1和0.20 μg·mL-1。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 丹参-红花配伍改善糖尿病心肌病小鼠的糖尿病症状

饮水量监测结果表明,与空白组小鼠相比,糖尿病心肌病小鼠的饮水量显著增加(P<0.000 1),在第10周增加了87.92%;丹参-红花配伍短期治疗给药和长期预防给药后显著降低了糖尿病心肌病小鼠的饮水量,在第10周分别降低了10.46%(P<0.05)和21.56%(P<0.000 1)。此外,丹参-红花配伍对糖尿病心肌病小鼠的体质量和能量摄入均无显著影响。阳性药恩格列净给药后会导致糖尿病心肌病小鼠体质量显著降低(P<0.05),饮水量显著增加(P<0.000 1),对能量摄入有增加的趋势。详见图2。

注:与空白组比较,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1;与糖尿病心肌病组比较,

血糖水平、胰岛素水平、OGTT和ITT实验结果表明,糖尿病心肌病小鼠出现了持续的高血糖及糖代谢异常状态。与空白小鼠相比,糖尿病心肌病小鼠的血糖水平在第10周增加了178.56%(P<0.000 1),血清胰岛素水平下降了72.55%(P<0.000 1);OGTT和ITT试验的曲线下面积(AUC)分别增加236.75%和88.79%(P<0.000 1)。丹参-红花配伍长期预防给药小鼠维持较低的血糖水平,与糖尿病心肌病小鼠相比,血糖水平在第5周和第10周分别降低了26.08%(P<0.01)和28.82%(P<0.000 1);胰岛素水平结果提示,丹参-红花配伍长期预防给药后,糖尿病心肌病小鼠的胰岛素水平上升了43.63%(P<0.05)。OGTT试验和ITT试验中,对0～120 min血糖水平AUC进行统计,发现相较于糖尿病心肌病小鼠,丹参-红花配伍长期预防给药后,OGTT和ITT的AUC分别下降了16.56%(P<0.05)和6.82%。丹参-红花配伍短期治疗给药对糖尿病心肌病小鼠的血糖、胰岛素水平以及葡萄糖代谢均具有一定的改善趋势,但无显著性影响。阳性药恩格列净给药后可以显著降低糖尿病心肌病小鼠的血糖水平,在第10周其血糖水平下降了46.06%(P<0.000 1),并对糖尿病心肌病小鼠的糖代谢异常具有显著的改善作用。详见图3。

2.2 丹参-红花配伍改善糖尿病心肌病小鼠的心脏功能障碍

超声心动图检查结果表明,糖尿病心肌病小鼠表现出明显的收缩功能障碍,主要表现为FS显著降低(P<0.000 1);丹参-红花配伍长期预防给药后对糖尿病心肌病小鼠的心脏收缩功能障碍具有显著的改善作用,FS显著增加32.86%(P<0.01)。糖尿病心肌病小鼠同时表现出心脏舒张功能障碍,具体表现为MV E/A显著降低(P<0.001),丹参-红花短期配伍治疗给药和长期预防给药后,MV E/A分别显著增加17.87%(P<0.05)和24.3%(P<0.01)。阳性药恩格列净可以显著改善糖尿病心肌病小鼠的心脏收缩功能障碍(P<0.01),对心脏舒张功能障碍具有改善趋势。详见图4。

2.3 丹参-红花配伍调控糖尿病心肌病小鼠心脏未折叠蛋白应答信号通路

未折叠蛋白应答信号通路的分子生物学研究结果显示,糖尿病心肌病小鼠左心室的IRE1、Xbp1smRNA以及分子伴侣蛋白GRP78和GRP94的mRNA表达和蛋白水平显著下调(P<0.05,P<0.01),PERK、ATF4和ATF6αmRNA无显著影响。丹参-红花配伍长期预防给药可以显著上调IRE1、ATF4和Xbp1smRNA,分子伴侣蛋白GRP78和GRP94 mRNA表达水平以及GRP78蛋白表达水平(P<0.05)。阳性药恩格列净给药后对IRE1 mRNA表达具有上调作用(P<0.05)。详见图5。

3 讨论

心肌病是由糖尿病、肥胖、冠心病、高血压、饮酒、家族遗传史等引起的多种心肌疾病的总称[18-19],其中,糖尿病心肌病特指由糖尿病单独引起的一类心肌病[7]。尽管糖尿病心肌病早在40年前就已经被发现,但迄今为止,糖尿病心肌病的病理机制仍不明确,仍缺少明确有效的防治药物[8]。课题组前期研究已经发现,丹参-红花配伍腹腔注射给药可以显著改善糖尿病心肌病小鼠的糖尿病症状及心脏功能障碍,在此基础上,本文进一步证实丹参-红花配伍口服给药对糖尿病心肌病小鼠的糖尿病症状,包括高饮水量、高血糖、低胰岛素、葡萄糖代谢能力受损,以及心脏功能障碍,包括收缩功能障碍和舒张功能障碍,均具有显著的改善作用。本文的研究结果为丹参-红花配伍防治糖尿病心肌病提供了实验基础,但潜在的药理机制及在真实世界的有效性仍需进一步探索。

本文采用的阳性药是恩格列净。恩格列净是钠-葡萄糖共转运体2(Sodium glucose cotransporter 2,SGLT2)的抑制剂,可以抑制肾近端小管对葡萄糖的重吸收,从而增加葡萄糖的尿液排泄,发挥降血糖的作用[20]。此外,心血管结局试验证实,恩格列净可以降低糖尿病患者主要心血管事件和心力衰竭的发生风险[21]。《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》已将恩格列净等SGLT2抑制剂纳入并发心力衰竭或动脉粥样硬化性心血管疾病或心血管风险高危的2型糖尿病患者的标准治疗方案中[22]。这些均提示恩格列净对糖尿病心肌病具有改善的潜力,本文揭示了恩格列净对糖尿病心肌病小鼠心脏功能障碍的保护作用,这与前期报道的实验结论相吻合[23]。此外,恩格列净对糖尿病心肌病小鼠的高血糖症以及葡萄糖代谢能力受损均具有显著的改善作用,但恩格列净在增加糖尿病心肌病小鼠能量摄取以及饮水量的同时,会导致其体质量显著下降,该作用值得关注和探究。

未折叠蛋白应答信号通路是维持内质网稳态的一种适应性保护机制[24]。生理状态下,内质网外膜上有PERK、ATF6和IRE1这3种跨膜受体,随时监测内质网中的蛋白折叠情况,如果错误折叠或者未折叠蛋白在内质网中不断蓄积就会诱发内质网应激,原本与分子伴侣蛋白结合处于静息状态的PERK、ATF6和IRE1就会先后活化,分别触发不同的信号通路来减少蛋白合成并增加蛋白折叠能力,最终缓解内质网应激,恢复细胞功能。分子伴侣蛋白在蛋白折叠反应中具有关键性作用,目前已知的分子伴侣蛋白有GRP78和GRP94等,其主要功能是与新合成的多肽链形成复合物并协助多肽链正确折叠成具有生物构象的功能蛋白质(图6)[25]。本文研究发现,丹参-红花配伍口服给药对未折叠蛋白应答信号通路上的IRE1途径及伴侣蛋白具有显著的调控作用。除内质网应激外,糖尿病心肌病的病理进程中还涉及其他病理机制,包括胰岛素信号传导异常、脂毒性、线粒体功能障碍、氧化应激、钙平衡受损、免疫调节失衡、冠状动脉内皮功能障碍及外泌体调节失衡等[23],丹参-红花配伍对这些信号通路是否具有调控作用还需深入研究。